请教各位专家老师培养CIK为什么出现这种问题

hyg5481655

我们的培养体系大概如下：E-vivo，不加血清，D0加入IFN 1000u/ml，D1加入CD3单抗50ng/ml，IL-2 300u/ml，按颜色变化补液，CD3单抗加到了D6天，IL-2一直加。前几天状态还不错，D6天的流式图发现有死亡的趋势，附了几张图片，各位有经验专家老师有没有遇到这种情况？( Y* Y* {  a  |* k: f! j" L
D0健康人外周血：# c" M  c' R" V

! k3 N; K7 L+ Y$ X5 N0 tD4：
' h% f' o7 `% O% I1 L3 ?6 }1 \0 f! J' Z; t( c, Q0 d  C8 @
D6：
& q' \* T% n+ Q
! H! P5 \% _% t# @! ?/ _D6的时候拍了几张照片：- r% Z2 d6 e, D# n* U
% \& K$ B) J. N2 L. e  O
" b1 D# C0 q2 m. P& i. S4 ]0 m7 `8 B

$ B3 e* C# i: \" r! ?5 z$ M: a! \1 I
可以看到D6的时候状态就不太好了，流式图中也能看到CIK的比例在下降
5 [( }& ^9 s* ]' ^' Q9 B请教各位老师几个问题：
; [( P3 L' \% p2 j1. CD3单抗只加一次还是一直加？文献提到只加一次，也有说一直加的
4 ?1 f* _+ C5 y* G5 S% d* {" r2. IL-2的量是否过低？. s* t$ B8 T5 P7 T) ]- s4 H
3. 镜下看到单个的细胞活性还好，有折光性，为何聚集成团的细胞看不出折光性？+ a: }# G! W! a8 {' N0 t0 P
4. 培养基的温度影响有多大？预热到室温还是37度？4 C% N' T% q! o1 `
$ g$ q' j  a0 p7 o8 p+ U

chenguangyu

1-cd3单抗加一次就够了，无需一直加。# \/ h) A$ ~$ s+ ~4 d8 {$ w5 q1 q
2-白介素一直加是什么意思？不用一直加，第二天之后只需在扩增或补液时补加即可。
% U5 q! R) t4 O' M3-从图中看，你细胞状态不好，杂质多，建议提更纯的单个核细胞，注意接种密度和体积。

hyg5481655

回复 小梓莜 的帖子6 |, w/ h* Q7 Z' b

" W7 m$ S: I' {  D$ m9 R6 o谢谢。

小梓莜

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. ]6 o) M4 a+ J0 o( S
7 H  G8 I$ k0 x+ k( a4 k" \自体血清灭活后，可以高速离心下，去除浑浊。转速和时间文献上不大一致，我们选用的是3000rpm,10min。希望对你有帮助

wilian2002

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hyg5481655

回复 yaxiao5708 的帖子- v# i0 _) `/ e, v; M& L

9 N# i" K) e! \; ~9 A嗯，已经分了加自体血清组了，我们提的自体血清有些浑浊，不知道是否有影响，热灭活的

小梓莜

回复 hyg5481655 的帖子8 y; z# e$ e4 C- i/ w
, }* {3 o: G* A; V- {
培养基和细胞因子都挺重要的，祝好运！

yaxiao5708

加自体血清吧~加了会长的好，以前我们不加血清就不大养的起来

hyg5481655

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: i$ x6 J5 e% }" w6 e. Q; u& _2 ~0 X
因为细胞一直没养好，养不到D14就死了，所以细胞数目、双阳率、活率什么的都谈不上。这周换了几种因子，貌似结果还不错，有了好的结果我再把结果贴上来。

小梓莜

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" N" h; i, d/ ]  t9 s5 }3 e$ K: ]
" {* x3 n, l5 k- \0 I4 R0 U我纯粹是做实验，养到过D21天，双阳性为40%左右，细胞数量3*109，活率90%。那我想问下，您那边养到14天，细胞数目、双阳率、活率均为多少呢？