请教各位专家老师培养CIK为什么出现这种问题

hyg5481655

我们的培养体系大概如下：E-vivo，不加血清，D0加入IFN 1000u/ml，D1加入CD3单抗50ng/ml，IL-2 300u/ml，按颜色变化补液，CD3单抗加到了D6天，IL-2一直加。前几天状态还不错，D6天的流式图发现有死亡的趋势，附了几张图片，各位有经验专家老师有没有遇到这种情况？
; l- t# b5 b, _+ W. l0 ~- w5 ]* T- QD0健康人外周血：
: t) y/ s7 }( ?. r6 [6 K) ?& F) g8 L8 u6 a( J- s9 Y$ p
D4：* T- V& C. D! U9 A
+ a9 g; J+ B4 {+ `* ?( A
D6：
4 o) b& A& c5 ^" ^  O& y8 s' C! [  y0 a$ A
D6的时候拍了几张照片：
% i9 ~1 v! ^. q
2 d# m, _0 y6 m3 g; F; u" V' l, R% v" |
* v9 h0 q; Y8 t6 Z

+ S5 G3 g3 M5 U* r可以看到D6的时候状态就不太好了，流式图中也能看到CIK的比例在下降. m2 g# O# a1 M0 y: D9 r0 C
请教各位老师几个问题：
5 o; ^0 @4 @( J8 P6 S2 j4 x1. CD3单抗只加一次还是一直加？文献提到只加一次，也有说一直加的
" c! N% f3 Y5 o: W% J9 h5 E2. IL-2的量是否过低？
; q& H5 L: X& D+ ?- C9 l3. 镜下看到单个的细胞活性还好，有折光性，为何聚集成团的细胞看不出折光性？- \$ F4 B) `! L4 o' {% G
4. 培养基的温度影响有多大？预热到室温还是37度？
8 G& i. T7 {' T+ k$ q% S  A. U# ]/ [: }
* S0 ]) Q. T' a+ {

hyg5481655

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- a1 \9 d2 a6 E- s  H$ z9 x! x: h# Z
( n5 I$ i/ t6 I" [纠正一下：上传的D0和D4天的流式图反了

蜗牛爱贝贝

1. CD3单抗我们是只加一次的，效果换可以，至于文献吗，你多做几次就知道那些可以参考了
3 |( Z9 B! y$ A- r: o. |2. IL-2的量我和你一样，不过要看细胞生长状态，如果细胞生长慢可以适当多加一些，如果细胞后期生长状态很好，可以稍微减一点量，6 L, g: N! v" U# ]/ i0 |
3. 镜下聚集成团的细胞看不出折光性肯定看不出折光性啊，细胞团投射能力低了，主要没有过多的絮状物就没什么大问题9 e! \" x* O+ @, A; s2 N+ ^7 Y; }
4. 培养基的温度影响应该没多大是啊除非你的细胞太过脆弱

hyg5481655

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9 i' E+ E5 q& t
, h3 r, K4 b, l( k, r5 ]谢谢赐教，请教老师正常培养出的细胞中会不会有像上面流式图中那么多的细胞碎片？CIK那一群细胞圈起来占整个events的比例有多大？细胞碎片怎么除去？是否可回输？

蜗牛爱贝贝

取流式时，尽量吧细胞吹打均匀，细胞检测结果合格就没事就可以回输啊，回输时过滤一下就好了，至于您说的细胞碎片，我也不不知道问什么，流式都是我们这其他人做的，我不好发表言论

fou321

很简单的问题，为什么不加血清？增值细胞必须加血清给营养他才长啊，亲。

luckyliu

看状态第一反应是长菌污染了，建议菌检看看，) t& Q+ B, f/ j" I$ j" \# a6 M
第二，是细胞刺激不够，没长起来；
! s! N+ H7 E! i. t8 i第三，细胞本身状态问题，可能免疫应答能力较弱，无法被刺激

hyg5481655

回复 luckyliu 的帖子$ [; S, j; T- ^7 ?8 v
7 V+ R/ Z3 m; X8 S: d1 P
老师您好，你说的细胞刺激不够是CD3单抗量少吗？我们用50ng/ml，还是IL-2（300IU/ml）?菌检没有问题

yuanyecat

你的CD3CD56双阳细胞不多啊

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子8 a% n4 L% x3 h! F$ a+ _& Q
- \+ C, s8 l. X
对的，没什么双阳细胞，健康人的血，没有经过IL-2等因子动员，D0的时候我们就看到没什么双阳和NK细胞，由于没有研究过人血，当时觉得可能正常，但是直到D6都没看到什么双阳细胞，所以就比较奇怪了。会不会是CD3单抗失效了？