探讨DC-CIK的培养

hyg5481655

前几天在论坛上发了两篇CIK培养不好的帖子，广大坛友提出了不少建议和意见，非常感谢。今天的结果出来了（x-vivo无血清，OKT3 50ng/ml，IL-300IU/ml，D8天混合）贴出来供大家评价，本人也有几点疑问想和大家探讨。
0 J6 M2 Y5 S9 z! C/ r之前D14的结果：
! h  ]3 x2 j7 H+ f1 Z! s- D% C9 E6 M$ i
这次D14天结果：
1 Q' g0 y2 {5 u+ S& S- Z
% W9 u5 W, T, {+ S; s* n" S
; @1 \9 n. |. O: \# F3 R' M2 ~两图是用了旧的OKT3（怀疑有问题）和新OKT3的结果，差别不大，所以不是OKT3的问题。8 ]) b0 C5 y4 ~+ V9 C5 g5 D
IL-2换了一批新的，所以怀疑是以前的IL-2有问题。7 G& o/ F9 ]: F: g# r: P2 R
现有几个问题请教坛友：7 H& V! K# S$ T( a7 j
1. 今天的流式结果可以看到我调高了FSC阈值，使碎片所占比例减少，相当于提高淋巴细胞群占所有events的比例，40%多，这个数据是否满足回输要求？) T$ H8 P" g, U* N) i- T
2. 细胞的数目不多。80ml的外周血提PBMC的时候计数为2*10的8次方，最后收获的时候竟然只有1.8*10的8次方，也就是说14D里几乎没有增殖，明显还是有问题？IL-2的量是否太少？% q; _& U* o; Y2 {1 A- v
3. 我们是用培养瓶培养，由于经常补液，我看到操作人员用175T的瓶子里面的培养基都超过100多ml了，是否是因为液体过多影响了气体交换导致的不增殖了？培养瓶和培养袋的差别大吗？
( M( H# f* {: k" z( Z" l4. 无血清培养体系和加少量血清（2%、5%）会不会导致细胞数目质的区别？这种情况加2%的血清就会让细胞数目的增长有几十倍？

lzlmiranda

1，这个问题很难回答，从双阳性比例上来说30%不低了，但是另外的那部分细胞占比还是有些大。
7 D+ v: C. k# J2，80ml的外周血分离出2*10^8的PBMC这个没问题，但是14天里面CIK一点都不长有两种可能性，病人自己的血液有问题，细胞活力不够；或者你的培养方法有问题，经典的培养方法第一天加IFN-γ，24小时后加CD3（OKT3）、IL-2,、IL-1α，之后根据细胞生长速度，补含有IL-2的培养液。IL-2的浓度不是一个确定值，我了解的从300——2000的都有，根据你自己所使用的IL-2的品质来摸索。
2 Q( d& k! K3 D, N3，培养袋的好处一个是方便操作，一个是省空间，如果不考虑操作的问题，培养袋和培养瓶单位培养基产出的细胞数目上有差别，但不会有质的差别。据我了解，175的培养瓶加液到150-200ml 的情况都有，所以你细胞数量差距如此之大，不可能是因为培养瓶的问题。
, o1 F+ ]1 P% s+ N; g+ V4，我曾经试验过用在无血清培养基里添加5%的胎牛血清做对比，效果并没有显著差异。另外重申，我做的只是实验，并没有进入人体。动物血清不应该进入细胞培养体系中。

lyj-0017

回复 hyg5481655 的帖子# _4 T! [$ _# b1 h
& o2 B9 d" l  A- d. q+ s" P
1、提高阈值对双阳细胞比例不会有太大影响，双阳比例能做到20%左右是行业的共识。
9 r' e- f+ R5 D2、IL-2浓度可以适当提高一些，500-1000U/ml较为合适，但你培养14天，细胞数量竟然比初始量还少，这点说不过去，你的双阳表型还挺好，不会是计数计算错了吧，数量级对了吗？' \, u8 i4 e6 v- Q9 Q
3、细胞培养过程中是可以看出培养液颜色变化的，100ml的总体积不少了。
2 R$ I; o/ f8 R( Q4、加与不加血清肯定会对细胞数量有影响，但不会影响特别大。

yuanyecat

回复 hyg5481655 的帖子0 W! i/ w, q) y8 Z* s
8 X' }* F  c( D0 t) a6 ?# F
1. 这个数据没有问题，一般CD3+CD56+所占比例超过30%，但是你还要看看CD4+CD25+的Treg比例是多少一般不要超过5%，细胞总体活率超过90%。9 }; k8 i- ?- N) Y$ ]% W
2. 我觉得没问题，重要的是DCCIK数目增加，你IL2的浓度是多少？1 ]  }% ]1 N2 m" `: B8 k- E
3. 培养液不要超过培养瓶总体积的三分之一。' w7 V$ J9 E4 o4 f& C
4. 目前来说，加自体血清的效果，DC和CIK细胞数目增殖远比无血清培养体系的好。

hyg5481655

回复 lzlmiranda 的帖子
; `3 P8 [6 L; N$ `8 K2 ?( ~8 x$ S8 {+ @
0 J( `) v- ~7 g谢谢您的回复，说一下自己的看法
$ ?7 g; u1 J$ P) a1. 这份血样双阳率可以，但是我也觉得P1群外的碎片有些多，至于这些细胞碎片会不会引起病人不良反应我不是学医的不清楚。& y# x: U- c+ T/ u0 b# w9 m
2. 补充一点血样是健康人的，活力不会太差，应该是培养体系的问题，方法是经典的，IL-2的浓度我们打算分组做做看效果。我们的细胞密度在2*10^6/ml，细胞密度会不会有点太大？% c" M) R+ l! w1 q; h2 U! A
3. 有人推荐液体的高度在1.2cm以下，培养瓶加多点液体应该也不会对细胞密度影响太大。' k9 s8 E0 p! ?7 [* O" U
4. 加点自体血清试试。

David_Chu

回复 lyj-0017 的帖子
8 I2 k" J0 Y. L8 L# r6 x1 E8 f) p) L& x% W( C; m* Z  Z5 ^
请问老师，细胞成团，你们是如何计数的呢？是强行把它吹散，还是有其他更好的方法？前几天细胞成团很厉害，是否说明增殖很厉害呢？我觉得不能等同。细胞在第几天开始会自行分散开来呢？

hyg5481655

回复 lyj-0017 的帖子
9 Y0 _% V9 b* \% E4 l, G% L/ {* l0 @
1. P1群之外的那些细胞碎片的数目有点多，有50%多，不知道是否会影响病人状况。" ?4 w9 a% q5 W  N7 @6 M
2. 这个数目很奇怪，之前的PBMC数的时候有部分红细胞，但是比例不会大，数量级应该没问题。
0 E& x! o+ x9 z  v3 r, W& Q$ Y. ?% Q% Y3. 我们看颜色一变黄就补液，到后面1天一补了。

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子
  X: z* T* p7 }) v0 L
1 z) w( [' O6 K$ P$ Q, b* I7 r6 g1. T细胞群外的那些细胞碎片对人体影响大么？Treg后面会检测。0 z$ }8 m8 V# C
2. IL-2 300IU/ml，不明原因导致细胞数增殖慢，而且D14的时候细胞团还有很多，有的很大，是否正常？

lyj-0017

回复 David_Chu 的帖子
1 j# n1 d1 P- k- u" z$ f$ m! l, f
细胞成团要分情况而定的，有的细胞成团需要每天吹散，否则细胞容易死掉；有的成团的是细胞已经死掉了，吹都是吹不开的，并且团块会包裹活细胞，这样的细胞可能长不起来；还有些细胞团，其实无需吹散，如果不动细胞，过几天就自动长开了。你没拍图片，不知道你是哪种情况，所以不好界定。

lyj-0017

回复 hyg5481655 的帖子: x6 ?: X5 F9 c. p2 o
7 G; ], R( Z) x, V( T
1、你那个图里面除了P1，左面那部分也还是活细胞，淋巴细胞表型检测，没见过阈值调得很高的，这样会把原本是活细胞的部分信号也切掉。如果检测发现碎片很多，有的病人会因此发生副作用。
5 Y+ _$ a5 Y6 O9 A! M) b6 s# \2、要么就是计数PBMC时计错了，要不14天的时间不可能在表型不低的情况下，细胞数目反而减少。
; A) N7 K; r& O8 W5 E3、根据你的描述，如果到14天时，细胞团还是很大，这就不正常，可能是增殖有问题。