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总RNA提取（TRIZOL法）
, R6 i5 k% w) e6 _% n1.主要试剂及配方
. v1 ?, d; c% }3 s; sTRIzol® Reagent SKU# 15596-018 # `9 @" |" ~5 A$ s6 N4 N2 ~
实验所需但试剂未提供的物品：
+ } c% G' Z( D9 b0 P5 j* 氯仿 （专用）# i$ C( B' ^, c3 J5 d
* 异丙醇 （专用）/ m, t& M5 B6 g
* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）8 e% H" f* X+ ]( q2 `. z& {- M+ A
* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟） : Z, l# J: n9 @& M( L. u4 L
) j3 e2 B$ Y$ O2 O( n
2.主要仪器; I4 P- X6 }8 l1 o) ~0 ^8 a1 A
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器
* l* p [6 M% v+ [6 j
; s% k e( r/ w# W: _3.实验步骤3 ], {. l% p' p# G$ j6 z8 m
㈠总RNA的提取
1 g2 K1 z7 D/ V5 C, ]% j! T1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）
# V% ~/ D9 Q1 T, H, k$ [a. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。
3 r6 f$ k) X% E6 ^4 l R% S6 x注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。, Q# n9 b2 Y9 Q2 ]' M9 K6 ~( _
2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；! K# t* {3 F1 z+ ?: z9 b! H+ R
3. 12，000×g，4℃离心15 min；
: W5 Y7 X' U! O7 P( Y% B4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
7 {9 e5 a; G+ E8 x7 D9 u5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；
, ~7 z) A/ X: n! L9 ^6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；
9 ]4 }+ C* i5 p+ q: x& G7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；
( p |, N. k2 L& A可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。" X2 j* J C% f5 U8 A x
8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。. i' U( L7 }( p( P J4 G1 H
9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度
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发表于 2015-8-18 09:53
