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总RNA提取（TRIZOL法）; V2 I: m! b4 }
1.主要试剂及配方# v3 r) a: H9 C8 f% g& F
TRIzol® Reagent SKU# 15596-018
0 z9 k: e* a/ B* r+ g实验所需但试剂未提供的物品： # b' f4 c1 r: |, N; T Q3 n- A6 p
* 氯仿 （专用）
Z+ L* N y# J# w, ^ J* 异丙醇 （专用）* ^2 p+ G4 `, c- @% _
* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）
# R5 V! y2 j8 J+ T* G6 b) e* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟）
2 D! p" W+ g) [7 W! k6 L8 x) q3 m9 T& K, E
2.主要仪器% @; B( z, i7 t. F$ g6 Q" X
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器# w% R# c8 b2 ~% I# S! Y
% \5 W4 w5 E( S, a. M, }
3.实验步骤
& ^# G8 u" u4 A+ l㈠总RNA的提取
$ T) `# x. g% t2 n" G1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）2 u, J b, _( B
a. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。
3 {: e7 X7 S9 l& I注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。
8 _9 w4 }0 ~3 z N2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；/ E; }" _( t' ]3 i& z
3. 12，000×g，4℃离心15 min；
$ z$ f, N" m3 |, g @5 e: Q4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
# v* r/ w! S0 X9 m* G% K5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；/ g8 t- N9 w5 C; D8 J
6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；
6 |5 r! W) f9 |; m7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；
4 V0 w C% H/ H; p$ C可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。
; k& d+ L: c9 d1 p( F0 s8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。5 ]! m+ D/ L$ u1 o+ y
9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度+ ?4 E5 p# J5 }8 [2 a+ U
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发表于 2015-8-18 09:53
