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总RNA提取（TRIZOL法）1 N M. Y* _2 d- o7 f' x% i& R: Z
1.主要试剂及配方' s/ N+ o/ X1 q
TRIzol® Reagent SKU# 15596-018
( I( p3 x' q4 l实验所需但试剂未提供的物品： $ D- ~- T; n; [' c
* 氯仿 （专用）, u0 o5 O2 y3 y' X+ i
* 异丙醇 （专用）
( ]) @+ v) m0 \1 @( x( c r8 @* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）* h- l& G, f4 a1 \1 I4 {7 {. ~
* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟）
% `' h/ W- I4 G' C: Y
9 T. N% @) `) r- a! D2.主要仪器/ V* [7 |% Z' a! `) r5 q
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器
+ ~6 O1 y8 B+ B& I
7 R6 D- B: C2 ]9 ^: C( m' j0 d3.实验步骤
8 _, Z: S& j. T% U. P3 ]: }㈠总RNA的提取
# Z% r) L2 p" H1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）
' u' {$ @+ i; q- V$ y1 i% Ba. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 , U0 D7 z. x8 o) w; `
注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。! U- @/ q! T; J' c. n5 e
2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；5 j/ ~: Y6 u2 q4 Q4 x
3. 12，000×g，4℃离心15 min；3 k' {# F& K7 S+ \. n
4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。4 r, N4 F4 ]+ g; v
5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；/ m! q3 k" A; ], e% @
6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；
3 q1 Q; m9 W2 @' | P: \) o1 C$ ~- n7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；
- N$ u0 Z1 }1 g& e可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。
$ m! r: \1 v+ q/ T3 @1 K8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。* L# W8 ~% p6 F# [) }% m$ p) f
9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度
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发表于 2015-8-18 09:53
