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总RNA提取（TRIZOL法）
4 K: c) x( o0 c1.主要试剂及配方0 L4 U% k$ g' H: p" ^
TRIzol® Reagent SKU# 15596-018
3 _* N% n: D- N$ o( ]实验所需但试剂未提供的物品： 3 N7 b1 X4 i. T3 `5 L* y6 X
* 氯仿 （专用）
) c2 j! I: X' T8 U* 异丙醇 （专用）
1 _* V' \# a4 O: h, f' q* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）
8 w% O/ T, M2 l* w* D/ k* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟） * B4 H# F2 D8 @+ c# N
# K) x8 y$ w7 {2 X+ C/ X2.主要仪器7 }% d" {* y7 {5 G$ G5 t
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器
- S" Q8 J# A/ S% |( ]# n. o* n: _# y0 ?. @( j
3.实验步骤6 i* n9 j8 t) x# f1 I- e! N
㈠总RNA的提取1 T8 d, r3 i! [ k
1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）1 @, O$ p5 F% ]# f! }/ P
a. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。
5 T9 ^" S$ ?/ Y# c& r! Q/ r: X注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。
: j. I* J6 \ S& A" P2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；. O8 q; T8 m8 L5 D, J1 x
3. 12，000×g，4℃离心15 min；* [# i; Q" K% Y) u" Q) x
4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
4 p7 B6 D0 r4 ]" C* ?5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；
% ^3 m- O9 b8 ]4 `) u& V& F* e6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；
" C' p, _* |+ B! r8 j& c. k. D/ Q7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；7 g6 w. G2 \% ^
可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。 n8 m% G" `, `4 d) X: Q
8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。# e0 ~! j& O4 H5 r$ ?' a, g, `! g
9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度8 i1 P# ]3 M, A' X9 a. ~! n
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发表于 2015-8-18 09:53
