有关癌细胞富集CSCs的实验几个问题

hangze037

回复 zz091115 的帖子! r/ k0 N5 ?% `, w

9 _) z+ X, @$ q7 g0 t- z! C您好，我最近也想做一些有关癌细胞富集CSCs的实验，但是从来没做过，周围也没见有人做过，所以很多东西不懂，想请教下您几个问题:6 U. U+ s" @7 ~' V% R! c
1.接板：细胞接板前需要用pbs重悬以下，洗干净原来培养基里面的FBS吗？细胞接板后，要不要间隔去晃一晃，有人说细胞在超低吸附板上也会有贴壁，需要不间断的晃一晃，请问有必要吗？
5 U$ D, j# s0 {9 P4 B0 k2.换液：细胞在培养的过程中怎么换液，离心速度与时间分别是多少，会不会把死细胞也一起离心下来了？需要全部培养基都换掉吗还是换一半？离心完之后重悬需要吹打充分吗？会不会把形成的肿瘤球吹打散了？5 W4 B3 b1 O3 s$ I
3.传代：细胞球形成之后，到什么程度需要传代？传代的时候用什么消化？有些人说用胰酶，有些人说用胶原酶，哪个适合？消化一般需要消化多久，什么程度才算消化完全，用什么终止消化，应该不能用血清来终止吧？传代的离心的速度与时间跟换液一样吗？重悬需要吹打充分，成单个散在的细胞吗？
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实验菜鸟没办法，好多东西不懂，以上问题比较多，迫切能得到解答，万分感激，如果有tumor shere formation assay 的实验protocol那就更好了，谢谢！！！

深海寂寞鱼

回复 lily132 的帖子# U0 K) X# @0 P+ J$ T3 L
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非常抱歉，才看到你的帖子。" \4 j  g8 J0 o. f+ G# Q
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U251时无法长出来非常漂亮的肿瘤球的。
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你可以试试U87，这个细胞系比较容易。

lily132

回复 深海寂寞鱼 的帖子# u0 v/ g8 w  P- U" O! O
7 o. K5 F  m" i8 z
你好，请问你做的是什么细胞系？消化传代后细胞增殖了吗？我做U251细胞，用tryple 或胶原酶，消化后几天，细胞就死了啊。ACCUtase 会比tryple 或胶原酶温和吗？

15389407467

学习啦！

深海寂寞鱼

回复 hangze037 的帖子0 N$ O0 [8 B# \+ G
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1. 我一般是加入新的培养基，然后用指尖Tap离心管底部，细胞自然就重悬了，基本上不用枪头吹打。# r$ d+ X. x: t2 i0 W" n* h

) J* h% ?6 Q+ h( {2. Accutase和其他消化液用法类似，只是可以不用中和。我是离心收集细胞后，弃掉培养基，直接加入Accutase重悬细胞，37度消化。
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3. Accutase我基本上加到能把细胞重悬起来为止。比如10 cm皿收集的细胞加1 ml Accutase重悬。6孔板一个孔 200 ul -500 ul都可以，我一般细胞稍微多一点。消化过程中间会用指尖tap离心管底部，让细胞充分重悬。

hangze037

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 X- B9 n: _2 m
8 @' J3 i- B6 U0 k% U# Y
非常感谢您的建议！回答的非常具体细节
% u: l7 M9 ~* R$ a: v我还想请教两个问题：
! U; Z/ i5 b$ T  f# m1.单纯培养过程中的换液，离心后重悬时吹打力度如何把握，才能避免打散已经形成的肿瘤球？2.Accutase是怎么用法，是需要先离心去掉旧的培养基，然后再添加进细胞吗？还是直接加进旧的培养基中？一个六孔板的细胞需要多少的Accutase？一般需要消化多久？如何中和？
; M6 V2 ^* ~% \谢谢！

深海寂寞鱼

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To hangze037战友：6 H# X4 L" ?0 r
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     1. 从你的描述看你想从培养的细胞系中富集CSCs，这个问题本身就是个问题，细胞系中是否存在CSCs是有争议的，而且即使能从细胞系中富集得到悬浮生长的TumorShpere，这样的细胞是否具有肿瘤干细胞的全部特性也很难保证。所以实验条件允许的话，尽量从原代肿瘤组织中富集。具体这方面的问题干细胞大牛Irving Wessiman曾经写过一篇综述的。你可以找来看看。7 U: d  Y5 A8 J! l; C

3 Z- i4 z& ]! F' U$ V     2.接种前细胞用PBS重悬是有必要的，甚至可以考虑用PBS洗1-2次。至于接种后时不时去晃一晃是没有太大必要的，非常辛苦但对实验结果没有太大影响。如果你们经费允许就用低粘附培养皿。
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     3. 换液可以用离心法（800 rpm，3-5min），也可以用自然沉降法。离心的话是有可能会离心一些死细胞下来的。自然沉降法根据TumorShpere大小确定时间，基本上肉眼可以看到TumorShpere沉降到离心管底。沉降法会丢失一些细胞。所以两种方法各有利弊，你自己权衡。
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+ X/ x) W  t. t     4. 传代的话，机械吹打和消化法都可以的。消化的话我个人比较喜欢中Accutase，很方便也很温和。如果只是普通传代，不是为了后续实验的话，吹打和消化程度都不用太彻底，差不多就行，但是我喜欢单细胞率高一些，因为这样传代后各瓶/皿的生长速度会非常均一。如果你传代的目的是要进行后续实验的话，尤其是定量实验的话，建议单细胞率在90%以上吧，这样实验的稳定性会很好。
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    谁都是从菜鸟过来的，多多读文献吧。你要的东西文献里面都有。0 O9 j1 K% q  V, F% J9 S

% S; ]/ Q$ S7 E, \1 I. q    祝实验顺利！