脐带间充质干细胞分离培养

babyrose66

做了两次脐带间充质干细胞的分离，用的是组织块贴壁的方法，步骤都是按照文献一步步来的，但是20多天，都没有细胞从组织块爬出，请各位大侠指点！拜托了

tingting2113

不知道您具体的实验方法，也不好分析呀。

wuhuaguo88l

细胞未爬出原因很多，如脐带尽量是新鲜的；华通胶剪碎，约3mm3；剪碎后，最好洗2-3次，减少粘度；最初要绝对静置7-8天；血清尽量用好点的，有利于爬出细胞；培养基要适量等等吧

babyrose66

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4 V/ Z3 h2 K7 ], S- W  j0 J
5 z" U) e$ m$ n7 r5 @组织贴壁方法，脐带去除血管，华通胶剪碎，DMEM/F12，10%FBS培养,现在组织块都是飘着的 ，根本不贴壁，13天了，完全没有细胞爬出啊

babyrose66

回复 wuhuaguo88l 的帖子0 d. J8 n$ \6 T5 R  X, f% s3 c2 |) y

) o4 n5 s5 C3 S6 Z, M0 U组织很新鲜啊 ，4h内的，血清是GIBCO的，没问题，10cm培养皿加10ml培养基，多吗，组织块都在漂啊,十来天都没细胞，看的我好着急啊，需要加些因子吗& u. _; z- s4 ^; a/ u) {- K* k, G

wuhuaguo88l

组织块都是悬浮的，细胞如何从组织中爬出来啊，我们是T175瓶才加25ml完全培养基，加EGF

menghy

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5 t8 K3 \- B; `- j7 B: z# I0 _% E: Q: k" ?7 O3 P
组织块贴壁法，顾名思义就是要让组织块贴于培养瓶细胞面上，如果都是漂着的，细胞根本不会生长。你可以将组织块剪碎后均匀铺壁，待贴壁几个小时候后再缓慢加入少量的培养液。这样细胞就容易从组织块中爬出细胞。

edwardellen

组织要剪得小，1个立方毫米左右。
4 ~; m% U0 P* b/ O& \; w组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。
# F# ~% F3 }5 r" p# E( b. V把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。
/ O) I' t4 F2 d6 Y组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。
6 O, A, {7 u& w, n加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。
# S1 j; V* x( U9 L; B0 R/ r加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。
5 M7 S# Y. L) S  }/ @$ p9 `如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。# p$ Y- N5 E( M
需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。0 Q4 S' }6 P1 r* U! \
脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。) \3 L- Q2 D9 Y  \/ g
从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。  H) c( x( ?. y& u; w9 ~/ ?% E$ P
除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。
- ~+ C& T9 K  F& Q: G" K/ W最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。

babyrose66

回复 edwardellen 的帖子8 P2 {  |  G, K3 X8 b: H

1 V  ?/ Z3 F# A1 E  q谢谢大侠，我再去做做看

月_幻影

铺瓶后不要直接加培养液啊，不然肯定会直接飘起来的，铺瓶后应该倒置培养4~6h（或过夜）后在加入培养基正置培养，一般7~14d即可会看到细胞爬出。