脐带间充质干细胞分离培养

edwardellen

组织要剪得小，1个立方毫米左右。& M' `/ ~/ p: _- p
组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。3 n# V/ W; y& g) Y) u6 S
把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。* A  Y0 O  W! O5 r
组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。
0 P* N0 K5 V/ b* @% O  {% M加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。8 J; ^1 d7 d# d0 a5 e$ W
加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。
/ s: {( J9 @+ q: h1 W如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。6 r8 K  z1 A! Z- j1 p- r& G
需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。) G& l+ q+ j/ D/ u4 M
脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。# s0 d& J3 U9 x- e
从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。0 R" z) {3 W+ ^: M- ^0 I* D9 K
除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。4 L% x8 R7 l% R% G
最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。

edwardellen

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- g: T* |, v) _( ~8 q. P4 d  ~4 x' k* i/ e( a( H# }
不知你的双抗浓度是多少，我觉得抗生素对细胞也是有一定的影响，如果你用的抗生素浓度大，而且还没有好好洗涤的话。5 j1 S0 r6 o) R3 h
至于运输两个小时，影响倒是不大，我做过放了将近十个小时的，也是可以出细胞的。: a; |- ^; o8 }
你应该还是从你接种组织块的手法，还有培养基和血清方面找找原因。
+ a- J9 I) N/ B( \血清很关键的，我曾经用GIBCO的普通血清，做了一个多月，好几例，死活就是不出细胞，后来换了德国的一个胎牛血清，7天就有很多细胞出来了。好像海克隆的胎牛也不错，可以试试。

edwardellen

回复 babyrose66 的帖子% D9 r& e; \) Y7 K7 t

0 M3 z+ ]0 S; S0 cGIBCO有新生牛血清

edwardellen

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那你们比较厉害，请问脐带是怎么保存的？我做过的都是24小时之内就分离培养了。. k4 X. [* p8 \' H9 A, N7 u
我最近在考虑以后要不要给孩子存干细胞，要是脐带放半个月也可以分出干细胞，那我估计我可以在实验室自己做。
+ O! G. Q; ]* d+ C看前面你说自己是脐血库的，有几个很好奇的问题，你们养细胞用什么培养基？用不用血清？还有就是你们用胶原酶么？我感觉胶原酶分出来的细胞没有组织贴壁的好，你应该做的比较多，有什么体会？

edwardellen

回复 20062926 的帖子) Y; {9 |' D$ q8 m

6 P. ?- T  B1 z( l5 v4个小时会不会太久了点，我之前问过一个复旦的，他告诉我2个小时左右，看着边缘有点干了就可以了

edwardellen

回复 20062926 的帖子
; g4 X; h( u6 x- O
( e# J# C5 z. c* S实验室有液氮罐的，不过存的都是实验用的细胞。: Y+ {# v- P/ t1 C0 u% N
排除利益因素，您觉得自己花钱存这个脐带干细胞意义有多大？
$ t/ z1 m: J& _( ^脐带血的造血干现在是可以用，脐带间充质让不让用？有那种给自己家人用的么？