脐带间充质干细胞分离培养

edwardellen

组织要剪得小，1个立方毫米左右。
1 [; V# q8 e, z+ Y* e! G' X, ^  A4 q组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。8 `5 ^: q0 {5 g# [2 }+ |
把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。4 v2 C. S9 W* z( L" i+ _8 [6 ?
组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。
* j* T) W* m7 ?7 {加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。; e5 C  c( j! v1 n8 o7 c
加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。
' ]/ \8 S4 X3 g9 c& A如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。8 J9 |) A$ B9 A. U
需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。
& L2 |) Q2 e' b7 M脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。
2 H. y% O  u7 [4 ^! T, [$ {从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。- Q# W! x: N8 H% [
除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。) M9 g2 X! E* _: d: `1 a- I/ t" c
最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。

edwardellen

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' ^% n7 m" V9 J9 e1 M$ O+ T3 W2 J不知你的双抗浓度是多少，我觉得抗生素对细胞也是有一定的影响，如果你用的抗生素浓度大，而且还没有好好洗涤的话。  `, [& L" c" o3 V0 Z5 `8 E
至于运输两个小时，影响倒是不大，我做过放了将近十个小时的，也是可以出细胞的。' h7 m% r2 Q5 Y: x6 Z- ?
你应该还是从你接种组织块的手法，还有培养基和血清方面找找原因。" u8 l$ G) q0 q/ \! {& f
血清很关键的，我曾经用GIBCO的普通血清，做了一个多月，好几例，死活就是不出细胞，后来换了德国的一个胎牛血清，7天就有很多细胞出来了。好像海克隆的胎牛也不错，可以试试。

edwardellen

回复 babyrose66 的帖子3 f# {, t! J% d5 G% f& i4 X
7 |) I, A- e. W5 y4 i
GIBCO有新生牛血清

edwardellen

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  p6 W) @# I7 b% o$ B% a" Y1 b  J! I. m% Z# H$ [% V: w6 `8 \) S
那你们比较厉害，请问脐带是怎么保存的？我做过的都是24小时之内就分离培养了。' q9 l5 l  Z; W6 U3 \1 \) v- T
我最近在考虑以后要不要给孩子存干细胞，要是脐带放半个月也可以分出干细胞，那我估计我可以在实验室自己做。
! O9 l- j4 |9 y- K& S6 f+ i; ]看前面你说自己是脐血库的，有几个很好奇的问题，你们养细胞用什么培养基？用不用血清？还有就是你们用胶原酶么？我感觉胶原酶分出来的细胞没有组织贴壁的好，你应该做的比较多，有什么体会？

edwardellen

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1 g' j& k. c/ `' W. X+ B
1 _# `9 e' e, \: L4个小时会不会太久了点，我之前问过一个复旦的，他告诉我2个小时左右，看着边缘有点干了就可以了

edwardellen

回复 20062926 的帖子
3 E+ D& e7 L/ U" T0 ]
5 p1 M1 F* m" _! m+ f2 z实验室有液氮罐的，不过存的都是实验用的细胞。& X3 g2 w' Q# o; t4 M
排除利益因素，您觉得自己花钱存这个脐带干细胞意义有多大？4 j' |  [4 ?. |9 g
脐带血的造血干现在是可以用，脐带间充质让不让用？有那种给自己家人用的么？