如何浓缩细胞培养液中可能存在的分泌蛋白

听不到

我取了培养干细胞24h的无血清的DMEM，想分析下它里面有什么干细胞分泌的蛋白能促进其他细胞生长，问过老师后推荐浓缩后跑一个SDS-PAGE电泳，查了下可以用TCA/丙酮法沉淀蛋白，但是查不到具体的做法...哪位大神能提供下TCA/丙酮法的具体做法啊？或者有其他可以分辨我收集的培养液里有什么明显的分泌蛋白的方法吗？thx~

playboy723

终极策略：  TCA/丙酮浓缩蛋白后可以跑个2-D电泳，然后打质谱，这样理论上可以得到所有的分泌蛋白。一般人我不告诉的，呵呵: P3 H/ d. h- |2 Y! P" [

  g  j8 D. S$ r# B$ k* n/ m" O: r

yinchong42

TCA沉淀就用百度查到的方法，很好用的，另外如果需要浓缩的比率不大，2倍或者3倍浓缩的话，有一招，就是在SDS变性的时候打开盖子，让溶液自己挥发，等挥发到需要的体积以后，再冰浴，然后如果是用b-巯基乙醇做还原剂的话，需要补充少许b-巯基乙醇，DTT的话就不用了

听不到

回复 tingting2113 的帖子; p0 C: ?6 I, F* f+ ^' T
- @0 ]$ b! }4 q/ z2 Y# h. R
好的，谢谢哈~

tingting2113

回复 听不到 的帖子" T1 o! Y! Y' _. r- t% ~: M
- M/ _' m9 s- l& U1 J6 ~, Z
是的，因为分离纯化是很困难的，看文献会有用。现在除了ELisa好像还有一种可以同时检出多种蛋白的，没记错的话应该是密理博他家的，没用过，可以问一下。

听不到

回复 tingting2113 的帖子$ _- i  B# f' \
7 R4 y; |3 C  I" w5 J( |( B' {
那就是说我要是想找分泌蛋白的话还是别从分离纯化这个方面考虑比较好是吗？多看文献来确定？

听不到

回复 playboy723 的帖子# i9 ?0 n" r, c: ?0 O% V! t

7 Y+ ?+ |* ~4 o我用了TCA/丙酮法，还蛮好溶的...

tingting2113

回复 听不到 的帖子
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! m6 z+ Y' R4 y) l干细胞分泌的蛋白很多，如果跑胶的话，条带会很多很杂吧，应该不好分析。建议可以查阅一下文献，看看里面主要的分泌蛋白，然后用Elisa验证。
  t' Q! n3 Q! o% \( l# ~我们老师建议不要试图将里面的蛋白分离纯化出来，那样不仅成本高，而且意义也一般，因为分泌蛋白对其他细胞生长的促进作用有可能是协同产生的。

playboy723

二楼的说法不负责任. E0 |, h+ y* m1 j7 A8 b7 @: ~% Y
超滤法和透析袋法都容易漏掉分子量小的蛋白，丙酮/TCA沉淀法得到的蛋白不好溶，将来做电泳时比较麻烦。但是理论上也只能用丙酮/TCA沉淀法，你可能需要先把丙酮/TCA蛋白复溶的问题解决了再谈下一步实验

xcf20305

可以买millipore的超滤管浓缩，或是冰冻干燥机冻干，对样品都不会有害。 ) t4 \$ W! q4 U; i
6 _2 v' I; k* M8 i! Y% j4 c
常用的蛋白质浓缩方法主要有以下几种，你可以在网上搜索一下方法，或许对你有所帮助。
9 w# c( j, D, J( K（一）透析袋浓缩法0 ~* v/ ^5 O8 k/ W5 O. n1 H2 v5 M& W
（二）冷冻干燥浓缩法
( T2 q0 A. T6 c; w! j9 H: {（三）吹干浓缩法
# e8 M0 v5 k( r* Y1 d1 v（四）超滤膜浓缩法
1 J  V) n! o/ u8 {3 o: |（五）凝胶浓缩法/ ~: t( F9 l9 t$ f" }# t
（六）浓缩胶浓缩法
2 ~& g3 }) e, U7 J+ k' x