求助一下各位关于fish荧光原位杂交的一些问题

伊沫

因为是新手，这个实验做了很长一段时间了，一直没有结果。现在整理分析了一下，也不知道问题出在哪儿，希望给为大神帮我看看问题出现在哪儿，感激不尽- [8 u& {7 u8 y$ `  O1 K( D7 a: I0 \
我说一下我的实验步骤，探针是根据目的基因cDNA序列设计的，长度25bp左右，这里有个问题就是荧光显微镜下看不到信号会不会是因为探针长度太短信号比较弱的原因，，
7 w0 K- c5 p" W5 D1 T# d$ L% C然后我的步骤大致如下：8 e" w* |. i0 u6 U" u% e
1，新鲜骨髓细胞涂片，自然晾干
. Z0 h, c% b. @# k3 h2. 4%多聚甲醛（DEPC处理）固定15Min, e! c4 O2 n# z& n, W
3. 0.1% tritonX-100 （DEPC处理）消化15min。之后PBS冲洗。
; H2 |5 i5 N; b  U- f4. 37℃2×SSC 溶液中浸泡30 分钟。室温下将玻片依次置于70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各3 分钟脱水。自然干燥玻片。
+ ^: c# `( U9 a4 a* m4 |5. 杂交缓冲液在37℃下孵育2h。每份标本探针2μl（两个探针各1ul）、双蒸水1μl、杂交稀释液7μl混匀，探针浓度1ug/ml,73±1℃水浴变性5分钟。将探针10μl加于玻片的待杂交区,盖上盖玻片，放于37℃的湿盒内杂交过夜。在杂交的湿盒内加PBS保持一定湿度。( y- e2 f9 r: A% H* G) x/ v
6. 杂交次日，将标本从37度温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉.将涂片置于65℃的0.4×SSC /0.3%吐温中洗涤2分钟,再置于室温2×SSC/0.1%吐温中洗涤2分钟,自然晾干。- v' n4 [/ `! e( `: ]3 Q. ]6 u
杂交缓冲液是自己配的：100ml
6 f' X+ K) C0 B, W7 E5 INaCl：5.265g, , n+ H% ?; @6 h8 t8 a
去离子甲酰胺：60ml                  终浓度60%2 F% T; }8 a1 ~. v
20xSSC:25ml                             终浓度5x) f& u5 M, P, }) P8 Z
10%SDS：5ml 或固体0.5g         终浓度0.5%
4 [8 Y3 ]/ H- ?/ l* ]硫酸葡聚糖：10g                        终浓度10%
# z6 T( I- l+ b% g# HDEPC水定容至100ml
' U8 _& F( H) M7 L/ J; A  b! k( Y( `2 W: r; A5 f+ K) A
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实在是不知道问题出在哪儿，希望各位帮我看看分析下，感激不尽~~

伊沫

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