ES 细胞培养攻略

勒夫

ES 细胞培养6 w$ o  s. M) u
原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备
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2 f% u; R2 X  G. t7 C; `1 ^1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死；
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2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；1 K# k- ^4 t5 P8 J
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3. 把平皿转入超净台；3 Q% B/ L$ p+ y' E3 M* U: t
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4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；
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5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；( l' L  O( F! x+ u/ o" ?8 w

: L9 p! _8 k; ^) ^! f2 w: c6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；5 g: P/ E4 {1 O& t7 @4 u$ u4 R: S2 m
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7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；. V0 n+ C# W+ d* \# a0 h  {' W  F, A
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8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；
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9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。
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7 J+ |, @5 @0 c$ {4 J! _7 t1 w10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；
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" B3 f* O$ k" q/ L11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；. y; J4 W$ Z& i& B) e

/ D7 V9 A) K# i9 |2 b! I12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。/ H" ^; D: e( r+ D
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饲养层细胞（Feeder）的制备) T0 H3 Y( F  O8 g/ q
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注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem）, `3 \3 F* o' g2 p2 X' P. H9 ?

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( ?& j# H5 U7 X1 y0 n) Z$ x; }1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）；( x( d7 a$ j( O) P1 Z
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2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）；; ]: c4 C- Z7 l( Z$ Y3 z( P
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3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；7 m+ J5 X, i" W6 g, _

5 n7 P* n9 D. A6 }4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；7 t9 a- Z# F- m+ G4 O- H
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5. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。
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/ C  P- C: x% [2 ]ES细胞培养基0 l' s- i  c" j5 G' M* c
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DMEM+15%FBS
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% C7 s( C; K) [6 L9 L0 @/ `2-巯基乙醇：5.5uM        & f5 X- U: F( ~9 c7 B

6 W1 D# U( o$ L7 h# p( W9 DL-谷氨酰胺：2mM        
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' z6 r/ d% t, w; LLIF：1000U/mL                         10000X        . J2 v( _" f1 K  A* J# \* i" J+ H
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非必需氨基酸：100uM                100X         5 K- m! Y/ _& d% i8 u
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双抗：                                        100X        ; N$ w. V5 \4 T6 P

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ES细胞的复苏
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1. 提前制备好相应数量的Feeder；
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2. 准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；0 V4 d$ w1 V% T) z, p1 k1 S4 @* ]
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3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；
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4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；
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5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。
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ES细胞的换液& z+ ~6 Q4 q4 W' b! u

& S* v$ d5 J2 n# U  V1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；4 Q  q4 _9 h: m) r3 {" f! I
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2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；
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; x% [7 c) ?3 Y3 k3 Q3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；
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+ v% N, v  H. z4. 放回培养箱继续培养。
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. u9 k- q3 _3 rES细胞的传代: P. a! W) U) R! _* h

% H0 t$ V4 _* [: `4 R7 P- _' u1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；. T6 d" h: ^6 F$ D7 m8 n0 j
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2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
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3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；' b8 Z  F, Y8 d3 G* y* S

$ z+ b- d- k& A) \6 Z+ ~+ t+ m4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来），滴加补加培养基至5 ml左右（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来；若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右），作好标签；
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9 V& h- L* J5 N0 ]9 d) u" A0 ?5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。
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ES细胞的冻存' s2 L; A6 ?8 e! Y5 S
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1. 常规方法将细胞消化成单细胞悬液；
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2. 转入试管，1000转/分钟离心5分钟； " `; f6 \4 U' B( s! ?% V2 B
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3. 配适量冻存液（为含10% 二甲亚砜（DMSO），10% FBS的DMEM培养液）；. V& I3 a3 O! l5 a. |$ _5 z
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4. 弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签；0 B' l$ B. ]5 c; M
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5. 放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。