ES 细胞培养攻略

勒夫

ES 细胞培养
& P. q3 H, o+ G% K' X: ^原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备
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1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死；
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1 z5 i5 H+ F8 _3 U2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；
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3. 把平皿转入超净台；4 d1 b8 W" J  n% s. Y: e
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4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；
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4 \, J& |& _( R! i5 R5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；& Z6 B0 a8 r# Z) c9 t1 \+ J+ w3 ]* d4 K+ Y

) ]. `2 Y) U$ `0 s, l' I# S3 M6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；' _( n5 b/ y. O/ B; v
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7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；$ T; ]9 A( T: {5 _9 Q  q8 m' u
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8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；
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9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。
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10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；
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11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；
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12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
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; \" f6 _+ ~" w饲养层细胞（Feeder）的制备6 W5 p3 ?1 X0 _4 C' s

$ B* U1 L# B% h- q注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem）$ m  s/ g1 Y  n) j* M& c2 P
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1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）；& G2 x& P2 @$ A# Q

5 e+ q+ i$ {8 T! _  Y2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）；
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3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；3 s7 S0 a4 D6 r* r9 ^
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4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；6 y3 P0 h5 r$ Z! c
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5. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。+ b- P% Q" V$ B
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ES细胞培养基
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DMEM+15%FBS
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- w5 z% C: J  d! D  V+ K) Z% H, b) E2-巯基乙醇：5.5uM        
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7 a/ |0 d  o/ q& G: K8 bL-谷氨酰胺：2mM        / Y5 y6 y7 n! P) P& f% u, e

: w6 ?: p3 t" _( FLIF：1000U/mL                         10000X        
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非必需氨基酸：100uM                100X         
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+ g' w5 e6 N# m. Z双抗：                                        100X        ; b8 l4 {: |0 W. `. j: N/ S

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ES细胞的复苏; h0 z! ~0 G' O  U
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4 ]3 N' s3 ?, a3 g4 f+ a" x1. 提前制备好相应数量的Feeder；
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2. 准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；* \- q& j4 K, U& \. x: b

) r4 s! H/ r: x! S" A1 s  j3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；& _0 n6 f" R* z; V) T0 Q* ?

1 m2 \. W) D' V1 c3 {2 K/ U1 h4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；/ [  a$ `9 f' s; ^- y6 j1 ?- @
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5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。
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ES细胞的换液
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1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
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2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；
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3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；
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/ }8 ]1 K1 g4 k! ^4. 放回培养箱继续培养。
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ES细胞的传代2 P# f1 B7 k( h6 R" |4 o
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1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；
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9 }; t6 j# j$ L2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
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4 \2 X$ ?# @2 N2 L4 v3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；
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4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来），滴加补加培养基至5 ml左右（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来；若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右），作好标签；
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; t2 ?4 D0 Y6 N9 M9 d4 j( n5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。
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1 j, |3 U+ O, }0 t5 I4 [. MES细胞的冻存; w, q2 f& u5 u. }

. ~8 s) H$ O. J3 u$ V' f. ?1. 常规方法将细胞消化成单细胞悬液；4 \* O6 l# }  O4 \
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2. 转入试管，1000转/分钟离心5分钟；
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3. 配适量冻存液（为含10% 二甲亚砜（DMSO），10% FBS的DMEM培养液）；# H: }& _2 C7 I7 |. N; E
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4. 弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签；7 z) y0 J7 U3 r! ]7 l, H

. v% i" [. j2 A; v8 D5. 放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。