脐带组织块贴壁法培养

yooung

1.操作方法：
8 b8 h( A% Q, V  \组织要剪得小，1个立方毫米左右。- k. Q  t. B6 _4 J, |! v& P" Z. ^4 |) J* k4 U
组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。2 G) R- T. y' O, q, w, h* _$ ~: }* u4 g- I+ a) _# y
把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。
( \$ |; Q9 C' Z组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。' u5 y8 W, \/ `& y9 Z1 y$ m4 I2 t) s1 Q$ P
加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。
- I+ Q3 Z6 T1 K. @加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。# ~) c$ ?1 m/ o* I! Q:如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。0 N# `. S$ _; R0 n3 I
需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。7 j6 s, Z* v6 W9 T; 脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。2 K9 g3 n, f5 e* Y4 @
从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。
: l+ q0 g- |& t* f; U; @# m) e" _7 V除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。0 w3 k# D( ]) D* \0 J7 {  u$ \0 Z! D$ _6 J
最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。  _3 L1 L* W+ h. Z2 |2 \

. f5 p0 |9 E3 z. V2.组织块贴壁法，顾名思义就是要让组织块贴于培养瓶细胞面上，如果都是漂着的，细胞根本不会生长。你可以将组织块剪碎后均匀铺壁，待贴壁几个小时候后再缓慢加入少量的培养液。这样细胞就容易从组织块中爬出细胞。0 i- V; @" N8 B
# ]% O( x5 U( N* [
3.铺瓶后不要直接加培养液啊，不然肯定会直接飘起来的，铺瓶后应该倒置培养4~6h（或过夜）后在加入培养基正置培养，一般7~14d即可会看到细胞爬出。
+ K; E" ^; C6 X9 V7 w
) Z# K5 W, @, o3 n4.还有 就是在运输过程中，脐带都是浸泡在生理盐水加双抗中，大概2个小时左右，做之前也是哪pbs冲洗一下。之后也没有pbs反复冲洗，是和浸泡的时间长有关吗？
/ l  y" L$ H' z9 L9 |不知你的双抗浓度是多少，我觉得抗生素对细胞也是有一定的影响，如果你用的抗生素浓度大，而且还没有好好洗涤的话。( w$ n6 B$ u8 }2 O) x4 Q, ~
4 X' U( Q- Q0 M3 T至于运输两个小时，影响倒是不大，我做过放了将近十个小时的，也是可以出细胞的。; Z4 Z) U" j+ _2 T) l( q4 M; M
你应该还是从你接种组织块的手法，还有培养基和血清方面找找原因。: B% y) Q* S5 _
血清很关键的，我曾经用GIBCO的普通血清，做了一个多月，好几例，死活就是不出细胞，后来换了德国的一个胎牛血清，7天就有很多细胞出来了。好像海克隆的胎牛也不错，可以试试。
, o2 w0 Q# A: _0 j# [  I$ t( n( |5 L5 S: U7 S2 e( D# Q0 J
如果是下午做的（3、4点钟）一般会过夜后第二天早上添加培养基再正置培养，如果上午做的完全可以倒置4~6h后再添加培养基即可；即使是过夜后添加培养基胶质也不会干的，因为是在培养箱内倒置培养的，又不是室内环境，我们一直都是这样做的，好几年了没有问题。5 r( u& K4 \  {, P! ~2 I6 `' l

4 k# R& V* r( \3 y
2 F2 q8 {! I: a: f1.组织块尽量小一点，我们实验室用的组织分离器处理，组织块基本上都分离成组织匀浆，培养效果不错。9 k5 T7 j. r, i8 B1 x
2.还有就是加入的培养基的量，只要能刚刚浸润组织块即可，不要加入过多，造成组织块悬浮，这样细胞很难爬出贴壁的。  k: K& ~' c) Q7 C
8 V& Z  c; w& @2 ^, Z5 C3.分享一个小技巧，可以先在培养瓶中加入少量的培养基，以25cm2为例，一般加入1-2ml即可，然后再加入处理好的组织块，3 v. S8 X& Z1 S1 O9 Q
; p; k$ i; D% E, S' r! h这样可以避免后加培养基将组织块吹散起来了可能性了。
2 N$ U8 I. d( j% I
2 z& j. a; _9 i9 b+ x1 l
2 U) Q8 G! t4 S6 U6 |0 X先分离华通式胶  剪碎  这个是越碎越好  平铺在培养瓶上  放培养箱干4个小时   然后再加培养基  按照组织块培养费 換液培养   这样可以解决你的贴壁问题    用干贴壁做 组织块能贴得很紧的   但是后续操作要轻拿轻放  不要让组织块被培养基冲下来；其实  由于华通式胶含间充质纯度高  用一般组织块贴壁法做 即使贴壁不好  也能长出细胞  只是细胞爬出多少的问题，你如果真的是没有细胞爬出  很有可能是你的培养基体系问题；我是脐血库的  天天养脐带，应该是这样8 l. m4 i( @: @4 U4 m

" S* H5 _8 P* m+ Y4 j2 R9 R# x) Q那你们比较厉害，请问脐带是怎么保存的？我做过的都是24小时之内就分离培养了。
" }# }5 x8 O$ X$ x7 B  N- d% T我最近在考虑以后要不要给孩子存干细胞，要是脐带放半个月也可以分出干细胞，那我估计我可以在实验室自己做。# F& j& e* G$ W, |* e) K% K6 L7 q! _6 Z  S& ^* g: L# t' L4 O
看前面你说自己是脐血库的，有几个很好奇的问题，你们养细胞用什么培养基？用不用血清？还有就是你们用胶原酶么？我感觉胶原酶分出来的细胞没有组织贴壁的好，你应该做的比较多，有什么体会？
, J" c( i" X" }) g! |% D0 F+ H/ k! F/ _8 ?5 D9 d& j- m4 D" ]! Y
肉泥只适合做干贴壁法吧，常规组织块法做的话  你剪这么碎基本长不出来细胞的，剪成2-3mm差不多，太大太小都不利于贴壁  这个只有你慢慢摸索了。
( b/ [1 I: m" P! Z) e1 e
+ _2 d1 N. t; a8 N; E) x" f! _
9 e2 D- S; C( `; K( @( X, p! g我是以前收集的一些资料，分享给你！