MTT实验接种细胞不均匀

聪明的一休哥

请教大家做MTT实验时，往孔板接种细胞时候的注意事项以及技巧。
0 H! I/ i" x; t: q+ q, q1、细胞选用的是小鼠成纤维。
$ @8 @' N1 j6 J+ @: h* o" q2、要求每孔接1000个，但是感觉太少，我一般接1800~2000个左右，因为血球计数板也比较破 国产的很便宜那种。也不知道计数的误差有多大，而且计数板也有个范围么，数量太小肯定也不准，一般密度大的时候计两次，再稀释。
$ v# V, k! O7 b3、计数后，把悬液倒在板槽里，用八排枪加样，每孔100ul。加之前反复吹了（Thermo S1移液器）加的时候每次加之前都会用排枪反复吹三四次。
3 g5 t8 n8 n. i4 X3 z4、加样并不快，一般从孔的边缘加，但是会有气泡。7 O0 @5 ^) t9 f$ i
5、接种后放置两三分钟，镜下看孔间的密度有差异，而且一个孔的也不均匀，集中在中间。7 {8 {2 U$ w" l2 C
请教各位怎么办？  i& |/ `* y) o" h  d( N  t
; t1 f# I4 ?( a2 t4 V
显微镜调好以后，移动培养板的位置，一开始这个视野清楚的，换个视野就模糊了又要调焦，这个是怎么回事设备太破了吗？）

tingting2113

回复 聪明的一休哥 的帖子; a$ ]4 U* ?! P' z  X8 a
2 d  [2 _# C4 h
1、任何技术方式都会存在误差，血球计数板也不例外，但是应该不至于会影响你的实验。
- `: v. R* Y0 d6 E5 a: D% Z; d5 N2、我做MTT的时候没有用排枪，和你的方法一样，也是从孔的边缘加。如果不嫌麻烦可以试试不用排枪，一个一个，每次加都吹打几次，看看会不会好一点。
- O* X. U0 ^$ x  k1 {" `" m1 A2 ?3、MTT法对接种的是不是均匀影响大吗？这个不是很了解。如果都集中在中间有可能是由于液体的表面张力，还有可能你看看你用的孔板，是不是平底的。- o0 H3 a* P$ y  w0 r  F+ j
4、显微镜就是需要随时调焦的，这个正常，不是设备的问题，如果换视野微调就可以了，也不麻烦。
" x* {% [$ M2 E' ]3 f; l

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子- n+ p" [7 F- `3 `% [1 f* Q+ p& d7 `
# Y2 T% N8 x" }' j3 ~! ^: v/ B5 s
非常感谢。* c4 ~5 Q6 e4 s$ t7 ~. r& _
1.计数板的问题确实不是大问题。8 s5 f6 R1 N& `+ ?4 G/ a
2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。( @5 m7 R: _4 J$ X, I* D1 n
3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。2 ?) P7 Z3 c# U! q, g" s' e- o
4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。
' W( N7 z+ E# i1 \+ y5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子
. n7 m) S/ m- @$ C! o1 D' o8 Z: P1 ~7 D+ K/ R+ H3 L6 K0 y
非常感谢。
2 `& y) Y1 W, h7 s$ A1.计数板的问题确实不是大问题。
" u( {% i5 S$ R0 o' P( K' }2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。
7 R- [6 y8 p; O, ?- u& t8 A3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。
5 ]& O! l4 U: g2 x; o: j4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。# g  v) e* g- [& d- I7 v; c1 M' F2 x5 D% j
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

genhaoxin

计数板对结果影响不大，即使在精确也有误差，重要的是保证每孔细胞量一致。你用排枪吹打混匀，那么细胞悬液的容器应该是培养皿之类的了，细胞悬液混匀效果估计不好，建议离心管装细胞悬液，移液管混匀，不用排枪，单孔加液，加两三孔混匀一下。之前用过排枪，感觉不是太一致。