MTT实验接种细胞不均匀

聪明的一休哥

请教大家做MTT实验时，往孔板接种细胞时候的注意事项以及技巧。
; Z" k% s  S; k  T" m4 }5 I4 b1、细胞选用的是小鼠成纤维。) J3 D9 [+ ?; [9 T
2、要求每孔接1000个，但是感觉太少，我一般接1800~2000个左右，因为血球计数板也比较破 国产的很便宜那种。也不知道计数的误差有多大，而且计数板也有个范围么，数量太小肯定也不准，一般密度大的时候计两次，再稀释。  `) E' @- }1 K/ G
3、计数后，把悬液倒在板槽里，用八排枪加样，每孔100ul。加之前反复吹了（Thermo S1移液器）加的时候每次加之前都会用排枪反复吹三四次。1 q; S7 d9 }; H. Q9 ~+ b0 s9 t7 ~& n
4、加样并不快，一般从孔的边缘加，但是会有气泡。
* }3 ]9 E2 Z/ N7 |5、接种后放置两三分钟，镜下看孔间的密度有差异，而且一个孔的也不均匀，集中在中间。# z' i9 `3 }: I1 U3 T
请教各位怎么办？
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" b* {5 x. `: [) n$ |& q; n2 }显微镜调好以后，移动培养板的位置，一开始这个视野清楚的，换个视野就模糊了又要调焦，这个是怎么回事设备太破了吗？）

genhaoxin

计数板对结果影响不大，即使在精确也有误差，重要的是保证每孔细胞量一致。你用排枪吹打混匀，那么细胞悬液的容器应该是培养皿之类的了，细胞悬液混匀效果估计不好，建议离心管装细胞悬液，移液管混匀，不用排枪，单孔加液，加两三孔混匀一下。之前用过排枪，感觉不是太一致。

聪明的一休哥

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& s* a2 I) p2 ^) g3 P2 ~& \% N6 w非常感谢。4 G. \+ o0 j. X  M6 M% m! V' ]
1.计数板的问题确实不是大问题。$ W3 s# x; f- m3 P
2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。  c% c& Z! n" y, L% N0 c) w/ U. w
3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。# B5 }. A5 Q" H% D; ^3 H( n/ T
4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。. x# @! p, q: f' m$ e  m" J
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子. C1 o0 g, Z6 t5 N( p6 ~6 H
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非常感谢。
4 b3 t. _3 k. e7 [! \1.计数板的问题确实不是大问题。- A' e9 P8 e" g1 E* o( r
2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。
8 C6 G- x: o) U' G  g3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。# I$ O4 w* K; O
4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。
8 p( \7 `9 b. o" m' }  }/ H5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

tingting2113

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" M# `# [2 e+ D2 a7 r1、任何技术方式都会存在误差，血球计数板也不例外，但是应该不至于会影响你的实验。
  w, M: `& d$ M2、我做MTT的时候没有用排枪，和你的方法一样，也是从孔的边缘加。如果不嫌麻烦可以试试不用排枪，一个一个，每次加都吹打几次，看看会不会好一点。% ~% I4 K& S* |, ~5 r
3、MTT法对接种的是不是均匀影响大吗？这个不是很了解。如果都集中在中间有可能是由于液体的表面张力，还有可能你看看你用的孔板，是不是平底的。
' }6 r( B% m0 B& y' h: u# j4、显微镜就是需要随时调焦的，这个正常，不是设备的问题，如果换视野微调就可以了，也不麻烦。2 E6 j5 Q. a+ _# k9 h