MTT实验接种细胞不均匀

聪明的一休哥

请教大家做MTT实验时，往孔板接种细胞时候的注意事项以及技巧。+ k( {' i, f* B6 R  N
1、细胞选用的是小鼠成纤维。! w) M1 \& t4 s. B  O. h7 z: t. `
2、要求每孔接1000个，但是感觉太少，我一般接1800~2000个左右，因为血球计数板也比较破 国产的很便宜那种。也不知道计数的误差有多大，而且计数板也有个范围么，数量太小肯定也不准，一般密度大的时候计两次，再稀释。
% V% B, H1 ]# }8 p. W: T+ I, f* h3、计数后，把悬液倒在板槽里，用八排枪加样，每孔100ul。加之前反复吹了（Thermo S1移液器）加的时候每次加之前都会用排枪反复吹三四次。
+ ]1 P# {* N0 t9 ?) I4、加样并不快，一般从孔的边缘加，但是会有气泡。' o( Q1 z. B$ _- g. G
5、接种后放置两三分钟，镜下看孔间的密度有差异，而且一个孔的也不均匀，集中在中间。
" R0 F. R' F! a; F- @3 F- m- I" q请教各位怎么办？
5 m! j5 P; B7 p) I
8 O) ~: ~8 I$ p显微镜调好以后，移动培养板的位置，一开始这个视野清楚的，换个视野就模糊了又要调焦，这个是怎么回事设备太破了吗？）

tingting2113

回复 聪明的一休哥 的帖子& [4 N9 T( d# y, `7 u2 ?/ C
6 W- A! }% o4 }1 }1 L' p$ n
1、任何技术方式都会存在误差，血球计数板也不例外，但是应该不至于会影响你的实验。) E" p# f* M% y/ U0 x5 J
2、我做MTT的时候没有用排枪，和你的方法一样，也是从孔的边缘加。如果不嫌麻烦可以试试不用排枪，一个一个，每次加都吹打几次，看看会不会好一点。7 ^3 N8 b+ Q/ W2 r9 P4 Q- U
3、MTT法对接种的是不是均匀影响大吗？这个不是很了解。如果都集中在中间有可能是由于液体的表面张力，还有可能你看看你用的孔板，是不是平底的。5 _8 R; q6 ]! [6 o
4、显微镜就是需要随时调焦的，这个正常，不是设备的问题，如果换视野微调就可以了，也不麻烦。
, g% u1 Y8 u7 I) g+ X3 V2 C4 [

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子
* ?3 p" m; m& j# Z/ H6 y, ~$ L2 R: f3 j6 r8 O3 G' q2 m1 x
非常感谢。3 a; J" [* }9 K
1.计数板的问题确实不是大问题。, T; _4 ?9 u% I
2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。5 R+ d. g( [  a) I5 w+ s
3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。
5 _" i& s) |2 c9 y5 V4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。7 P/ [& S: g4 D6 C( ]+ X
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

聪明的一休哥

回复 tingting2113 的帖子) l6 z* p! L* t/ s0 d; J5 W4 J
0 b. q+ R/ D  z- h
非常感谢。$ d9 n. u; j: m0 t: w
1.计数板的问题确实不是大问题。
0 b# b# S( z! k2.细胞可能吹得不均匀，一孔一孔加感觉误差会更大，我是横着加细胞，竖着加样。
, b" _5 E6 v- K0 G3.孔板这个我没仔细看过 待会儿看看。还有就是孔间细胞数目差异太大，排枪加的都不匀。: l- Z/ L9 q* h% j1 q  w8 M0 h
4.不是高倍换低倍的时候调焦，是同一倍数下 移动培养板看不同孔的时候都要调。9 z( ^1 |- l* o0 q
5.我今天该加MTT了，刚看了 唉 失败了。

genhaoxin

计数板对结果影响不大，即使在精确也有误差，重要的是保证每孔细胞量一致。你用排枪吹打混匀，那么细胞悬液的容器应该是培养皿之类的了，细胞悬液混匀效果估计不好，建议离心管装细胞悬液，移液管混匀，不用排枪，单孔加液，加两三孔混匀一下。之前用过排枪，感觉不是太一致。