T载体克隆

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引物的拉出的pcr片段3‘端是有一个磷酸基团的吧，只是引物的5’端的磷酸修饰是可要可不要的，特殊实验需要标记时，往往在5‘端标记。所以总体上来说，虽然引物上没有磷酸基团，但是每个pcr片段的3’端都是有一个的，而克隆时有这一个就够了

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回复 bjshan 的帖子2 Y2 R3 u+ ~0 t, [. `9 H1 B
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因为PCR时用的是dNTPs

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楼上的观点基本上是对的，但是有一点，3‘端的磷酸基团并不是通过加A才有的，即使不加A，3’端也是有磷酸基团的，加A只适用于T载体克隆，因为KOD是平末端的，所以要加A，但是加A之前PCR产物也是有磷酸基团的。我有用过天跟公司的载体，他们的不叫T载体，因为他们是平末端的，这种载体KOD-PCR后的产物，直接就可以去做克隆，不用加A。3‘端有磷酸基团我觉得就是我上面说的原因。个人看法，不认同我的话也不会影响你做实验的。

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PS：天根公司的这个载体，是zerobackground的。T载体不能保证百分之百是阳性克隆

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上面诸位同仁，首先我要说声道歉啊，其实我上面的回复只是自己的想法，我想了想，是说不通的。所以我赶快查了资料，又跟同学们确认，发现自己的确错了。现在我纠正自己的错误。6 f# A$ b$ W7 f( \' Z
首先回答楼主的问题，同时纠正我的错误：T载体大多是通过EcoRV等平端酶切割，然后加T做成的，这个过程中，T载体是没有去磷这个过程的，所以T载体是有磷酸基团的，至于自连，T载体理论上是不会自连的，T载体自连最可能的原因是加T的反应不彻底。PCR产物是不带磷酸基团的，因为引物的5’端没有磷酸基团。我们平时用的克隆引物都是不带磷酸基团的，这个上面的回帖人akxiaoqiang 可以去确认一下，原因有两个：一个是制作工艺的原因，引物的5’端需要偶联在一个位置后才能合成，所以如果要把5‘端加磷的话，工艺就多一步，而且这一步又是多余的（如果你只是做克隆的话）；二是引物5‘端如果有磷酸基团的话，PCR片段本身会自连（这是楼主引的那句英文的意思）。然后连接酶作用的条件是5’端至少一个磷酸，和3‘端的-OH。所以PCR片段可以和T载体连接。
- v2 ?- A# `& r' W# V. K$ Utaq酶的加A也并不能加磷酸基团，只是为了配合T载体的T粘性末端。我上面的帖子也是错的，因为PCR的3’端是没有磷酸基团的，只是-OH，这个楼主是对的，我错了。
- N' o2 W3 `  }( N/ {# Z$ h; W至于做单酶切的克隆，载体是要去鳞的，这样的话，就跟T载体不一样了（T载体是有磷的），但是要连进去的片段同时也是经过酶切的，所以它的5‘端是有磷，满足了连接的条件，可以做出克隆。0 a) W5 C; w/ T1 N- ^) \1 D
不知道我的意思楼主听明白没有？对之前我的错误认识道歉，希望能纠正一下，改变像我一样错误的认识

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不好意思，我要向大家道个歉，我对上面帖子的回答是自己想当然的认识，我后来想了想，是说不通的，在这里向大家道个歉，回答了错误的答案。有一点其实楼主是正确的，PCR产物的3’端是-OH ,今下午，我又搜了相关的资料，加上和同事的讨论，纠正一下我之前的答案
$ \2 u; k# Y6 C) q% c$ X. K首先我先回答楼主的问题，PCR产物是不带磷的，但是T载体是带磷的。公司的T载体的做法一般是用EcoRV等这样的平端酶切割后，再加上加T这个过程做出来的，之间没有任何去磷的步骤，所以T载体是5’端是带磷的。但是T载体本身理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因我觉得是因为加T不彻底造成的。PCR产物也是不带磷的，原因是引物的5‘端没有磷（楼主问的英文翻译），这个问题上面说有的那个同仁可以去核实一下。我们做克隆的引物5’端一般是没有磷。这主要有两个原因：一个是工艺上的问题，引物合成石时5‘端需要固定在一个地方才能合成，所以是没有磷的，如果要加磷，工艺上就会多一步，而且这一步对于分子克隆来说绝对是多余的，特殊要求的除外，如标记探针等；二是，引物如果5’端有磷，PCR的产物5‘端就会有磷，这样pcr产物就会自连（楼主问的英文翻译）。形成串联体。所以引物是没必要在5’端有磷的，pcr产物也是没有磷的，也不会是taq酶加A加上去的，这个楼上有个同仁也错了。& b: e( x: y3 S/ S
连接要满足的条件是5’端至少一个磷酸集团和3‘-OH，只要满足了条件才有可能连接成功。我们在做单酶切克隆时，跟T载体克隆也是不一样的，主要差别就是磷到底是谁提供的，因为单酶切克隆时，载体是要去磷的，这样载体就没有磷了，而T载体的磷是在载体上的。单酶切克隆的磷是有片段插入片段经过酶切后在插入片段的5‘段产生的。
/ ?$ R; N1 |! x; K' ~& A以上是我觉得正确的答案，我首先纠正一下自己的错误认识，同时也纠正一下上面那位我确定你的确错了的同仁。

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我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个 可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。& ]0 m  P7 ?, q0 J2 Y
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

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我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个 可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。% P& y, T- b* a+ q  v% x
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

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" w$ M, @; y6 B9 Z  i  M0 W! Z" s0 o5 w6 f# g/ B# n! Q
是的，是这样的。两条链会有一条有个切口（切口和缺口不是同一个概念），而且是在细菌体内修复的。

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缺口和空隙指缺碱基，相应英文为gap。; y( p$ z2 X6 U. h' O
切口为缺磷酸二酯键，相应英文为nick