T载体克隆

bjshan

现在正准备用T载体克隆一个基因，于是查了查有关T载体的文献。在“Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products”这篇仅有一页的文章中，作者写了一句话-“Vector self-ligation events are prohibited by the 3' thymidine overhang, and concatamerization of the insert is prohibited by the unphosphorylated 5' end, contributed by the oligonucleotide primer, as well as the 3' adenosine overhang added by Taq polymerase during the PCR reaction.”这里的Concatamerization是什么意思啊？引物使扩增的基因5‘端去磷酸化，但是这样的话，PCR产物如何与T载体连接啊？

hndxws

引物的拉出的pcr片段3‘端是有一个磷酸基团的吧，只是引物的5’端的磷酸修饰是可要可不要的，特殊实验需要标记时，往往在5‘端标记。所以总体上来说，虽然引物上没有磷酸基团，但是每个pcr片段的3’端都是有一个的，而克隆时有这一个就够了

bjshan

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% L3 T& h  B. b& B- {5 d! L8 S- U6 p( @% q% `) c6 @- l3 A
为什么3’端有一个磷酸集团呢？不是-OH吗？

akxiaoqiang

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( s6 x; }) T, z8 A- N2 h* R, _* h  a6 ]3 `
5端的磷酸化是由引物提供的，而3端的A是由Taq酶在PCR反应后的产物上加上去的。载体的5端应该是去磷酸化的，不然容易发生载体自连，大概是这样。建议楼主查看中文文献即可，因为T载体克隆较容易，国内已做得非常好了，英文文献就免啦

bjshan

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. C; l6 o; B0 L- ^1 B# S# v) g& A: X, m% S( g$ P# x/ k
谢谢了。

lugu167

载体的5端应该是去磷酸化的，不然容易发生载体自连，大概是这样。不过一般PCR产物连接T载体，非常容易成功，多挑几个克隆，即使有空载也容易排除。

hndxws

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- V8 K( X! C) I; ]5 a% P5 _, n( r6 \8 n" Z4 H2 K1 z
因为PCR时用的是dNTPs

hndxws

楼上的观点基本上是对的，但是有一点，3‘端的磷酸基团并不是通过加A才有的，即使不加A，3’端也是有磷酸基团的，加A只适用于T载体克隆，因为KOD是平末端的，所以要加A，但是加A之前PCR产物也是有磷酸基团的。我有用过天跟公司的载体，他们的不叫T载体，因为他们是平末端的，这种载体KOD-PCR后的产物，直接就可以去做克隆，不用加A。3‘端有磷酸基团我觉得就是我上面说的原因。个人看法，不认同我的话也不会影响你做实验的。

hndxws

PS：天根公司的这个载体，是zerobackground的。T载体不能保证百分之百是阳性克隆

不倒翁

T载体有平端的 也有带T的粘性末端的+ a6 F+ E1 @' i4 P5 ]/ r1 n- V( P