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不好意思,我要向大家道个歉,我对上面帖子的回答是自己想当然的认识,我后来想了想,是说不通的,在这里向大家道个歉,回答了错误的答案。有一点其实楼主是正确的,PCR产物的3’端是-OH ,今下午,我又搜了相关的资料,加上和同事的讨论,纠正一下我之前的答案
- Z# r6 e* D$ l首先我先回答楼主的问题,PCR产物是不带磷的,但是T载体是带磷的。公司的T载体的做法一般是用EcoRV等这样的平端酶切割后,再加上加T这个过程做出来的,之间没有任何去磷的步骤,所以T载体是5’端是带磷的。但是T载体本身理论上是不会自连的,因为末端都是T不匹配,自连的原因我觉得是因为加T不彻底造成的。PCR产物也是不带磷的,原因是引物的5‘端没有磷(楼主问的英文翻译),这个问题上面说有的那个同仁可以去核实一下。我们做克隆的引物5’端一般是没有磷。这主要有两个原因:一个是工艺上的问题,引物合成石时5‘端需要固定在一个地方才能合成,所以是没有磷的,如果要加磷,工艺上就会多一步,而且这一步对于分子克隆来说绝对是多余的,特殊要求的除外,如标记探针等;二是,引物如果5’端有磷,PCR的产物5‘端就会有磷,这样pcr产物就会自连(楼主问的英文翻译)。形成串联体。所以引物是没必要在5’端有磷的,pcr产物也是没有磷的,也不会是taq酶加A加上去的,这个楼上有个同仁也错了。5 ?( C' p! \$ q. v6 @. e
连接要满足的条件是5’端至少一个磷酸集团和3‘-OH,只要满足了条件才有可能连接成功。我们在做单酶切克隆时,跟T载体克隆也是不一样的,主要差别就是磷到底是谁提供的,因为单酶切克隆时,载体是要去磷的,这样载体就没有磷了,而T载体的磷是在载体上的。单酶切克隆的磷是有片段插入片段经过酶切后在插入片段的5‘段产生的。3 v. Y2 a2 t5 W% t0 \
以上是我觉得正确的答案,我首先纠正一下自己的错误认识,同时也纠正一下上面那位我确定你的确错了的同仁。 |
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