T载体克隆

hndxws

上面诸位同仁，首先我要说声道歉啊，其实我上面的回复只是自己的想法，我想了想，是说不通的。所以我赶快查了资料，又跟同学们确认，发现自己的确错了。现在我纠正自己的错误。
: r' I9 N  e$ I4 R. ^5 {7 F首先回答楼主的问题，同时纠正我的错误：T载体大多是通过EcoRV等平端酶切割，然后加T做成的，这个过程中，T载体是没有去磷这个过程的，所以T载体是有磷酸基团的，至于自连，T载体理论上是不会自连的，T载体自连最可能的原因是加T的反应不彻底。PCR产物是不带磷酸基团的，因为引物的5’端没有磷酸基团。我们平时用的克隆引物都是不带磷酸基团的，这个上面的回帖人akxiaoqiang 可以去确认一下，原因有两个：一个是制作工艺的原因，引物的5’端需要偶联在一个位置后才能合成，所以如果要把5‘端加磷的话，工艺就多一步，而且这一步又是多余的（如果你只是做克隆的话）；二是引物5‘端如果有磷酸基团的话，PCR片段本身会自连（这是楼主引的那句英文的意思）。然后连接酶作用的条件是5’端至少一个磷酸，和3‘端的-OH。所以PCR片段可以和T载体连接。
0 ]  w9 c$ L* B3 `) Y- k! _) m$ S6 \& Staq酶的加A也并不能加磷酸基团，只是为了配合T载体的T粘性末端。我上面的帖子也是错的，因为PCR的3’端是没有磷酸基团的，只是-OH，这个楼主是对的，我错了。  J7 p1 q1 L* I4 `6 v
至于做单酶切的克隆，载体是要去鳞的，这样的话，就跟T载体不一样了（T载体是有磷的），但是要连进去的片段同时也是经过酶切的，所以它的5‘端是有磷，满足了连接的条件，可以做出克隆。
' z: D( m  A5 J3 A不知道我的意思楼主听明白没有？对之前我的错误认识道歉，希望能纠正一下，改变像我一样错误的认识

hndxws

不好意思，我要向大家道个歉，我对上面帖子的回答是自己想当然的认识，我后来想了想，是说不通的，在这里向大家道个歉，回答了错误的答案。有一点其实楼主是正确的，PCR产物的3’端是-OH ,今下午，我又搜了相关的资料，加上和同事的讨论，纠正一下我之前的答案
: m- r- }+ c6 W9 K6 X9 W" B! b首先我先回答楼主的问题，PCR产物是不带磷的，但是T载体是带磷的。公司的T载体的做法一般是用EcoRV等这样的平端酶切割后，再加上加T这个过程做出来的，之间没有任何去磷的步骤，所以T载体是5’端是带磷的。但是T载体本身理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因我觉得是因为加T不彻底造成的。PCR产物也是不带磷的，原因是引物的5‘端没有磷（楼主问的英文翻译），这个问题上面说有的那个同仁可以去核实一下。我们做克隆的引物5’端一般是没有磷。这主要有两个原因：一个是工艺上的问题，引物合成石时5‘端需要固定在一个地方才能合成，所以是没有磷的，如果要加磷，工艺上就会多一步，而且这一步对于分子克隆来说绝对是多余的，特殊要求的除外，如标记探针等；二是，引物如果5’端有磷，PCR的产物5‘端就会有磷，这样pcr产物就会自连（楼主问的英文翻译）。形成串联体。所以引物是没必要在5’端有磷的，pcr产物也是没有磷的，也不会是taq酶加A加上去的，这个楼上有个同仁也错了。
0 i! v; C" T9 @, }4 \$ A% D7 s连接要满足的条件是5’端至少一个磷酸集团和3‘-OH，只要满足了条件才有可能连接成功。我们在做单酶切克隆时，跟T载体克隆也是不一样的，主要差别就是磷到底是谁提供的，因为单酶切克隆时，载体是要去磷的，这样载体就没有磷了，而T载体的磷是在载体上的。单酶切克隆的磷是有片段插入片段经过酶切后在插入片段的5‘段产生的。3 d5 u8 s5 X$ l5 d$ p$ }; j
以上是我觉得正确的答案，我首先纠正一下自己的错误认识，同时也纠正一下上面那位我确定你的确错了的同仁。

hndxws

我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个 可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。- g; H/ s* C& D  b1 i, R( j0 _
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

hndxws

回复 bjshan 的帖子4 }4 A$ K/ }$ ?/ o$ ?+ D

! A: d0 f3 Y# I3 H2 R" P我连续写了两次帖子来纠正自己的和楼上一个同仁的帖子，都不见了。我也懒得写第三次了。我首先道个歉，我给楼主回答错了。楼主这点是正确的，pcr产物的3‘端是没有磷的。这个磷不是taq加A时加上的，也不是引物上带的，引物的5‘端对于普通克隆来说，都是没有磷修饰的，磷在T载体上的5’端，这个 可以看看T载体的制作过程。连接酶作用的条件5’段至少有一个磷酸集团和3‘端的OH。4 N3 Z3 J. s) T* a
顺便翻译一下楼主问的英语：T载体理论上是不会自连的，因为末端都是T不匹配，自连的原因可能是加T时不彻底造成的。pcr产物也因为引物的5’端没有磷因而也不带磷，为了防止形成串联体，taq酶加A后可以与T载体连接

bjshan

回复 hndxws 的帖子
2 C9 `4 m2 B! E) m9 e5 Y
7 A2 A" z+ y7 a1 o- M% C" |首先，我对你对待问题的态度感到吃惊，能够如此费心解答别人的问题的人在生活中一定是个热爱思考、有责任心的人。现在，我对你的辛苦表示感谢。再者，我想再问一下，是不是5‘端没有磷酸的PCR片段，与T载体3’端连接时，因为两者都没有磷酸，会在这条链上留下一个缺口，导入到目的菌后，由菌的修复系统识别并修复呢？

hndxws

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( u% X$ i1 W/ N. d
5 B9 `  K; I4 c% v, ^是的，是这样的。两条链会有一条有个切口（切口和缺口不是同一个概念），而且是在细菌体内修复的。

bjshan

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4 {) K0 C9 ~% R+ U- R8 \1 @( h5 m& w$ b9 |
留下一个切口，你说缺口和切口不一样，那么nick指的是是哪一个？

hndxws

缺口和空隙指缺碱基，相应英文为gap。( V2 ~( j% e+ T  x6 p) M
切口为缺磷酸二酯键，相应英文为nick

bjshan

回复 hndxws 的帖子6 |& S: p+ A! c( k6 p/ U4 ?# V

7 @/ L# m; \$ j4 ]) r知道了，谢谢。