求 兔骨髓间充质干细胞分离方法

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兔骨髓间充质干细胞分离方法如下：1 y' r& C( J  K5 h' z, q$ S0 ?1 k
1. 1月龄家兔一只，称重，1%戊巴比妥钠，30mg/kg,麻醉，这是一般的标准剂量，具体用量得看你自己兔的耐受性，我们有时候用到了40-50mg；- _. U* q- @8 ~- e
2. 仰卧位固定于手术台上，常规备皮（双下肢），活力典消毒三遍后铺无菌巾，无菌巾我们用的是科室换药碗的那种无菌巾；3 i& B; l* E* L0 @7 |: f6 y+ e
3.穿手术衣，戴无菌手套，将手套的包纸可以铺到无菌巾上进一步达到相对无菌的状态，周围放两个换药碗，可以放无菌的器械；) a% ?, ?% ^) {# _6 y
4.无菌刀片切开胫骨至股骨皮肤，逐层分离直至暴露两根骨头，从膝关节处分开股骨胫骨，然后分离股骨，可以用刀片沿关节面划开，相同的方法分离胫骨，如果可以你也可以分离兔的前肢。0 a! _/ S0 A$ I/ ^0 g
5.重新消毒，同法取对侧股骨胫骨，将取下来的骨头放至无菌培养皿中，放在冰上，转移至超净工作台下，彻底清除骨周围的肌肉组织，准备三个新的培养皿A，B，C，其中一个A装PBS液约15ml,冲洗用，取其中一根骨头从干骺端剪断，只需要剪断一端就可以了，用10ML注射器吸取PBS液反复冲洗到B培养皿中，直到骨头发白，冲洗下来的骨髓用枪头或者注射器反复吹打至细胞悬液；8 \$ [7 y+ s5 \' @
6.细胞悬液用直径70um的滤网过滤成单细胞悬液，移到15ml离心管中，1000r/min,10min
/ b4 I  h) g1 k- H. G' \7 a9 w" C，倒掉上清，5ml15%低糖培养基反复重悬后接种至两个培养瓶中；
. ^$ ~8 g9 L' ?, \9 T7.48小时半定量换液，以后隔天换液，贴壁时间大概在8d左右，贴壁后如果有杂细胞，可以用PBS液冲洗。
4 q/ X. }% m. n: @# \" s2 I8 ^: p实验需要准备的器材7 `5 M$ l  Y( o. B, E
取动物的器材：5ml，10ml注射器，麻醉用；
  m0 }! O; ~) g' y9 R* _7 v& ?                        活力碘，酒精，生理盐水，纱布，棉球，手套（无菌，一般都需要），口罩，帽子，刀片，镊子，剪刀，弯钳，无菌巾，无菌培养皿，冰，；! W4 v; b# @0 @; `6 Q
                         针线，人道主义精神，杀死了还是要缝合的。+ P# A& D! @1 ]2 m
超净工作台需要的器材- J2 {" r4 b" s1 q
                        无菌培养皿，PBS液，无菌剪刀，钳子，移液管，枪，枪头，酒精灯，无菌手套，注射器，滤网，离心管，培养瓶，培养基等。) v) A6 z" x8 w" G
PS：这个实验是需要搭档的，一个人不好完成的，最后祝你实验顺利。

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补充一下，滤网滤成单细胞悬液到培养皿C中，然后转移到离心管中。