求 兔骨髓间充质干细胞分离方法

joeandanna

如题，非常感谢

细胞海洋

http://www.stemcell8.cn/search.p ... mp;searchsubmit=yes

jhu132llh

通用的干细胞分离纯化方法基本优化一下条件是可以通用的+ v* C- a) o! o7 u  `' ^
如密度梯度离心还有差速贴壁什么的

joeandanna

回复 2# 细胞海洋
3 L% s' G0 O3 C6 N& [9 S8 F) \) \! k2 n- O0 `
: h/ G3 e9 ^0 B' n( b7 I) w
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兔骨髓间充质干细胞分离方法如下：$ r1 n2 @5 ]" n+ d) v
1. 1月龄家兔一只，称重，1%戊巴比妥钠，30mg/kg,麻醉，这是一般的标准剂量，具体用量得看你自己兔的耐受性，我们有时候用到了40-50mg；
8 S$ ?5 h" i0 `+ i9 o. M6 Q) J* h) w# ~2. 仰卧位固定于手术台上，常规备皮（双下肢），活力典消毒三遍后铺无菌巾，无菌巾我们用的是科室换药碗的那种无菌巾；
4 P; \" I( f3 p% V3.穿手术衣，戴无菌手套，将手套的包纸可以铺到无菌巾上进一步达到相对无菌的状态，周围放两个换药碗，可以放无菌的器械；
9 X# n* `* n9 i/ v% M2 h4.无菌刀片切开胫骨至股骨皮肤，逐层分离直至暴露两根骨头，从膝关节处分开股骨胫骨，然后分离股骨，可以用刀片沿关节面划开，相同的方法分离胫骨，如果可以你也可以分离兔的前肢。7 `  L) R( b' Z) m5 d* a
5.重新消毒，同法取对侧股骨胫骨，将取下来的骨头放至无菌培养皿中，放在冰上，转移至超净工作台下，彻底清除骨周围的肌肉组织，准备三个新的培养皿A，B，C，其中一个A装PBS液约15ml,冲洗用，取其中一根骨头从干骺端剪断，只需要剪断一端就可以了，用10ML注射器吸取PBS液反复冲洗到B培养皿中，直到骨头发白，冲洗下来的骨髓用枪头或者注射器反复吹打至细胞悬液；. m  i% u( a$ }1 ~( i4 s' U
6.细胞悬液用直径70um的滤网过滤成单细胞悬液，移到15ml离心管中，1000r/min,10min
7 q) {4 ]) I$ |7 ?( _，倒掉上清，5ml15%低糖培养基反复重悬后接种至两个培养瓶中；
2 Y  Q  K2 T; s: ]: |8 L! L7.48小时半定量换液，以后隔天换液，贴壁时间大概在8d左右，贴壁后如果有杂细胞，可以用PBS液冲洗。
# q" r  R8 w1 L$ a" j实验需要准备的器材1 K) G3 k& n, M- ^  z$ Y) H
取动物的器材：5ml，10ml注射器，麻醉用；
; `! p9 P0 U8 Z7 j% ]/ a, \                        活力碘，酒精，生理盐水，纱布，棉球，手套（无菌，一般都需要），口罩，帽子，刀片，镊子，剪刀，弯钳，无菌巾，无菌培养皿，冰，；
' O7 V& X+ y) e1 R: D. r7 s                         针线，人道主义精神，杀死了还是要缝合的。( p9 p5 e) Z/ X/ x8 Q! O6 X
超净工作台需要的器材- z$ z0 z+ l( x, a2 Q' O" u
                        无菌培养皿，PBS液，无菌剪刀，钳子，移液管，枪，枪头，酒精灯，无菌手套，注射器，滤网，离心管，培养瓶，培养基等。0 T) E1 x/ r" {
PS：这个实验是需要搭档的，一个人不好完成的，最后祝你实验顺利。

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补充一下，滤网滤成单细胞悬液到培养皿C中，然后转移到离心管中。