u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。
0 C, K+ E( q% y. K有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

/ ~# ~0 \$ C4 r$ K2 S$ Y, R) _0 y/ x# z
/ e8 \6 a7 K5 g# Z0 w
你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：
$ V6 b. p- h+ B* a5 ?8 d
8 g  u" K9 p/ R# dSURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III
: D5 i3 B$ I: P5 c! N: ?http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283
+ M- T$ E' W. Q1 c# f% R/ x2 X8 w& _
& Z# d* a* ]% H6 X
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
5 P# l5 h' X9 R第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。) \' T0 c$ f8 T$ Q) t
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。6 ?( p' T* r4 L" k, t6 ~
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
2 t% R6 Q( u( J4 n5 B& e* ?等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。
# M1 `- s, z* u0 k0 P: m" T% ?  o所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。  o  E8 M! P) ^
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子
) m$ \& D+ U* ]' I8 g/ [& ]9 S/ Y( R  Q3 Y& C  N9 X$ q0 X9 {$ e
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达; e/ B* x, ?7 A7 q: [& {3 p) O" @
. N& J$ U" u* D7 p6 a
同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。5 M: ]- K. z* S4 q! D& u
( J7 r# J! I( R. K5 B# k, k- {
官方Protocol也证实这一点：$ X2 w1 ?! V' e1 Q2 I

5 A3 P9 K, H; T' n2 A) yhttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
) q& o! G/ V: w0 b

hughliang

2 ^4 F6 ~4 F2 L& U, K1 n) ?. K9 k4 M+ B; x! U$ G5 D2 g
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
2 R; j$ a8 a) G1 T; [; C; w
4 d5 \. O7 O# A/ q5 |  [8 f. E2 ~* M表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。2 H3 l/ a! T5 S( Z
: h4 T, d/ a% X, [
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
5 ~4 j1 n7 K& c! {
. g# \: ~" ~5 U5 A- U, u9 O" h/ y向大家请教原因和克服的办法，先谢！& h; V, |8 b1 U+ Z9 @( @

fguw

回复 hughliang 的帖子" V$ Q7 x$ D' y7 M& [
% _" u+ b9 r, [+ U7 g5 R8 w1 N
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，
2 s$ \+ ?8 K" q( w6 @" g7 X) {6 J6 t没有实验结果验证，猜的
! d- y: b* q7 a0 j% @  y, K作普通转基因有类似问题，3 t; {) a, P8 ?* c
有问题，欢迎探讨

runsong

: v0 c- H$ E0 a" O* ~* a
" b. P/ ?3 X  }! X" l. @6 A回复 hughliang 的帖子6 |. R  F6 g4 i1 s0 Z% A9 h

( C- X' h3 a5 k  T2 {十分感谢，你提供的线索太有价值了。* ~- K$ B/ i3 S0 q
即pll3.7中
" Q0 e5 i7 F# X0 T0 W6 SAn HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.6 Y6 I/ {. R. ~) S! ^
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
7 g  [& l( y7 O9 ?, v而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。. U6 t- b& {, n" [5 b- @
《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）