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楼主: hndxws
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[请教] u6启动子的问题 [复制链接]

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发表于 2011-8-16 13:53 |只看该作者
fguw 发表于 2011-8-16 02:24 % C4 g- L. v7 q
回复 hughliang 的帖子
, t& j& d1 D8 ^( S+ g, j+ o- Y; q# Y
可能是长时间后慢病毒失活了,所以,不再有KD,

* e; x# A4 y/ E$ ~( v是有这个可能。
$ D2 ]! V  R( V) y* B3 j  C* r. _/ Y" U
但流式证实转染细胞仍有荧光,我在想是否细胞能补偿干扰的作用。
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发表于 2011-8-16 14:10 |只看该作者
runsong 发表于 2011-8-16 12:23
) J3 }. j5 s; S  l8 ^回复 hughliang 的帖子
6 K  n- n( G8 G& D8 u% z2 T1 _$ {7 E: l2 _3 @$ U
十分感谢,你提供的线索太有价值了。

( n! W5 k/ r8 z6 [% b! P4 t不客气+ C/ Z) p: g1 `
/ r: o5 _3 F. l
也分享两篇供参考
9 r1 K% i" g- M& j0 g0 v0 Q
& M3 U/ ], y% w9 t祝实验顺利
  D4 p  @0 u* e5 c
" ]7 S) Z  K' d$ F* h2 M

pLL3.7_stemloop_design.pdf

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pLL3.7-shRNA.pdf

590.77 KB, 下载次数: 15

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发表于 2011-8-17 01:51 |只看该作者
回复 hughliang 的帖子; }- ^: U) ?& R$ B5 \) b6 ?( r

4 I0 h# p) d. o+ J# Z我觉得你做试验的细胞是多克隆?没有挑单克隆?& a/ s) k4 M( [* K) i& }; F; V
流式证实转染细胞仍有荧光,大概阳性细胞比例多少?; J( b2 Z% z6 `7 ?# n% v( h$ u
如果比例比较低,可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞(失活)信号。所以KD效果不好。
' k) n; P" r& Y! t还有,SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS,可能在不同的LOCUS活性不一样,当然,我不太认同该观点。
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发表于 2011-8-17 02:27 |只看该作者
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回复 fguw 的帖子& [$ ?& G  t- v

% B( `- Y. h% b3 o是的,偷懒没挑单克隆。
- [+ O' D, K- ]. G! D$ x' V2 N( y
( P  p* f+ [5 Y/ x1 b/ @9 N0 ~! J我一般流式分选或G418筛选,但没挑单克隆。
. m+ C0 y+ Q: J, i0 R
2 n% I1 u8 p, u& z! a流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多,可能对干扰效应有影响。
* [2 R: l' Y6 a; r% y. u+ p# T! A7 \) g: P* ^9 `( k: M5 V7 G, R
谢谢!
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发表于 2011-12-6 00:32 |只看该作者
回复 runsong 的帖子4 x; ]! u) i7 y* |  h6 r; x8 o

6 v9 ~, P% v2 X7 S& R; j8 {您好,我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo:酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT5 r2 a5 J4 q% G/ ]
reverse oligo:酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C  D' e5 L3 K2 F1 z
- b3 ~8 U% g) k6 x1 Q$ t, @& t
我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的,还需要加G吗,你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7,酶切位点是Xho I,NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。
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发表于 2022-3-29 22:01 |只看该作者
膜拜各位大神
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