MSC诱导分化专题

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样本:
4 C) G' t$ c: qMSC向成骨细胞的诱导分化
+ s! ^) n% v. p' C4 i$ u: `(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；) J! N# s! p3 g3 S: m5 S7 L) T1 P
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；) T. H: j8 I6 M  ^, d# Z
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。- V) D5 O) z+ c
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
6 z7 i0 d% S% H7 y6 \, h(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；1 r6 y9 {% \+ J1 _* I9 f7 P* X2 C
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；$ v9 e$ A* O6 e5 x
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。0 S1 G* e. R; k: L) L8 Q
MSC的成骨和成脂肪的检测- ~% S+ Q7 Y% d+ ~7 ]
茜素S染色方法
- o1 z* c, _- f* }(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;) {! V, q, I2 i& n
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；2 h( L5 [8 i0 _1 y
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。% @4 g: q  m1 A9 t  R  b
苏丹Ⅳ染色方法+ y  I4 _( h) n( n- f( s
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；; z& M9 u; }6 T2 c
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
0 ]5 n) m. g6 X0 o; M0 S(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导+ i4 |0 ~. t9 f5 Z* k$ J4 s8 U
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
* F4 e! o" e0 I+ J6 s9 W, O种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
+ D( o" G/ R7 T软骨细胞诱导液:5 L! G' e' m) _) n2 S6 W
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF' j$ ^* l  ?; R9 E5 D7 W
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
" N( g( [8 g9 c+ A9 N* k; T5 k体外诱导MSCs向神经细胞分化
1 T# D: F3 P- v# Y+ q取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片0 T9 V! q" N3 \8 z# Z
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs8 `( f0 J7 I, a* J
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h2 L1 @$ R/ n1 g$ V- k) ^( [
后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化1 u$ B$ E  \6 [+ a4 a  d& g: u
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
. m1 ~  [, l6 Q; p' |; d3 T4 s2 d茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
4 q6 @% n' R2 C: R
" S, M$ f( W5 E4 s4 v; o$ n  R成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
! k, w: v8 u( I) [/ q油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
$ b( n8 y0 D1 s) M" k  @DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达; h+ b4 O( z' |* q! _% q

  }5 d9 y! T5 L4 j2 x1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097# I' y1 e' Q# m; ]
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.' y$ [" Y) Q5 f0 j0 J5 x4 H3 K
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation9 U& R$ i# @7 m6 ~+ C9 q' M" q
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
; s0 l+ I9 W% T7 S! b( P* x3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化2 i& \" A  K7 t3 q, E5 y7 ^6 Y
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞! \2 h, |$ K7 g* E' _( i
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
2 }6 b. M' \+ D" T) `茜素红S染色法步骤：
+ M& V5 u* h% K) {2 t(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次+ r% O/ ^9 _9 T& A
(2)茜素红染2min。
- T" ~( @$ X% D  M+ z3 m: u& K9 R(3)蒸馏水洗5-10s。, D; j, o  Q0 _* ]% X
(4)分化液洗15s。6 V5 M! t  m+ B
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。' u3 V8 J+ I, e6 X9 x: m2 d. {
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
  I; ~9 j& b" j( q/ R" _以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成, \. n0 }8 q6 D
油红O染色法步骤：$ H# }$ H9 @$ N) x- @+ J
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
. E! z1 N; G0 M1 y$ H9 p: y& z(2)4%多聚甲醛固定15 min;
' W. L& U2 \$ P1 j3 E+ {8 q* N(3)PBS漂洗两次，每次5min;: y' V" |0 u/ s$ t; W, Q! M
(4)入60%异丙醇漂洗。1 G/ W& g+ ^! A
(5)入油红O染色15分钟。
- g- f4 M5 I! dDevil60%异丙醇漂洗。
9 ?" f) K% d4 {8 a. V, A5 N2 R! M6 q% ?; w
3.rMSCs成肌细胞诱导分化) `) K0 D8 b, Y' X$ h3 L
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
4 O9 @) y6 h  h) J5 `4 i7 C参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
: G3 _" q9 b+ E! ~. @4 g- {一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
! i: f# W% V7 u- W7 G3 G: E2 d1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。2 U. R4 H; \+ K4 R! C; U5 o  C- {: j
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。8 u$ {6 f: g8 S  b5 k9 p# j
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
) K* m& I5 y2 B8 J4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
- u; _' V5 X% b& y/ @# t5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
- B: n$ A$ @: l! d9 v6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
6 p4 ^! `) \6 _3 t" S7 K7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。2 o/ w5 M7 `( f" F' R1 O
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。8 Q8 T  e9 I2 s+ r3 E' U: e
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
1 }5 ?1 \( Q2 r" x. b! {. Y二、诱导分化实验：
. C( v4 a$ c7 d6 k5 Z6 K取PP6进行诱导，采用两种方法：
. ^  U" u5 W5 M0 V% \1 b  I+ n! R$ z+ O2 v2 `& }
1、共培养诱导：
0 q- @% x- }( L3 q细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
/ u, [3 U3 p) x* g另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。% M; u, @9 v5 t. X9 P
2、直接诱导：
+ o( z. U  _( |. o5 U+ _: L) W细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。9 C' x7 w0 S# I  F
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。9 H  I- A7 C) h: s- X8 o
/ I* v0 f& U: J8 D7 V3 m
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
; a, W! ?* ~& C
7 {; B' i$ v. x% j
6 Q- ~* l  V5 Y5 xQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:/ s, S2 _" D2 G
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,$ B. d6 {- h% s: v7 ^
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞7 U1 y1 r  k% a2 r) [+ `
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞/ x1 {& h9 s/ q, F8 H

& U1 s( J$ _5 ?! S2 F$ m; F2 u1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。6 M8 \) ?/ q/ s% Z2 J3 q( s$ J
! C8 U: X  R( M- _" [. l* x! N
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。, p3 H. ]- r) \' h

% x: ^4 E: k$ A" C3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
4 X5 X( W* c+ N( _; m4 c- r5 y6 Z" P: F: d1 R" X5 q
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
" C4 D3 \0 r- @* N$ e. N$ o, f' v! h9 }6 t
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
5 G7 U7 i- |- l/ q" j; ^: g% P3 q5 L" l5 x2 Z& ~7 f4 r' [
参考文献：7 h* Z' P1 k, n4 P
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.2 a  U$ J) ^$ g# ~% h' `( E
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl
7 a5 h9 T+ S2 K. e& ?9 ^1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
' I9 l4 D$ W' h/ ]诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。' g  Y/ ~( Z; e
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化' Q: V% k8 q5 S: V. b
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
' ?: R5 p( v: X* U$ w% t3 x8 P1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化2 g9 U5 N# q6 c( ^! d: d1 X% c
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
4 H! n8 l, a# |0 t# U# N1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
( }6 R$ j1 K1 E/ M+ Z6 g$ }9 q诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。) ?. X2 o5 c( ^7 x) U7 Z
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
+ b* d/ y2 X/ Z& [! D& L诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。0 N3 E5 v& z- w6 y: n/ p
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
' I1 d# R& [3 u% r" p1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
* s; d1 |% q% @* {诱导剂主要有5-氮胞苷。& G" z- p  G3 T/ [/ \& g1 N+ [
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化+ e, P: l; Z' O
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。