MSC诱导分化专题

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样本:" q1 Q( M9 U8 d+ W
MSC向成骨细胞的诱导分化
; t9 I( l% j$ X8 Y(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
) }6 H5 T* C' [8 G) ~. ]/ k3 u5 J2 S3 I(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
! R% P) R* ]" o& z% N(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
/ a5 [, E# i  _7 c, R, Y3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化1 q9 ?( [9 }, b" |! |- ~
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
' ~, V& S; {/ |8 {/ V& Q(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；
  E' f" h' L" n$ X(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。. N$ a7 Y' S' i$ m# q' C
MSC的成骨和成脂肪的检测% B7 i  l0 H  d" b% d& o6 @/ R. s4 C
茜素S染色方法# }6 X9 y6 y0 o$ g8 R" c9 r+ p/ x
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;7 T) S; Q- ^# O$ r7 x- J. I8 F0 x
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
* T$ z9 |3 O, @8 m/ x1 r(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。( T9 \" X$ l$ r7 P7 C: C2 w
苏丹Ⅳ染色方法) H4 h* U3 [0 Z$ T2 G
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；" H2 h. Z! N5 F2 |' z( S
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
  b  n# J6 C# u(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导5 U0 f; _( M5 O0 x# {
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接" L% C9 Y7 Y% V: B- z. {* u
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
' Z8 ]- W& ~# l! w/ T# K软骨细胞诱导液:
+ U, l8 N. ]& `- j, q& `7 D" ODEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
9 p9 Q* x& v9 y+ p-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
3 F/ q. N  B: ~6 I4 B, J, _体外诱导MSCs向神经细胞分化
# T) a4 Q8 c  F% @5 Q% W4 a; V% |取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片0 T& B$ }" g+ p1 m% _5 Y
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs4 L8 \# c- F. r2 ?! z3 _
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
& i3 w3 Y7 B6 W/ W' q后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
; d( u' J3 G# r5 U& k) X成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。6 W" I* X8 j9 B0 ^8 S3 s4 }9 C
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。$ S  e' p1 f2 P# K- }2 e# G7 k
( g7 l. ~1 k7 y
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
9 J0 L! i' Y1 r! _油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
' Q0 o' z! F' q! J: d2 L1 gDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达$ f7 b% l" b' X& D0 B$ @

- \( I- L' U+ V& }1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
; _* k+ {; r3 U7 i  J7 c- z! l" i5 Z2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
0 V) W2 m" f' @, a5 n1 VHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation2 E" z" r2 S' M
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
  m0 ]- b7 F+ L, i5 s; a3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
$ N+ r% ?2 X/ d2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
4 R3 h, g3 u* A9 {- {3 C( O以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。0 g: H; X/ _2 N  l
茜素红S染色法步骤：0 S& O; _) Y" y" J" ]
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
! g$ ]. d2 B6 A& L: `; o(2)茜素红染2min。' T$ C: u! s! ]2 d/ X8 c# F
(3)蒸馏水洗5-10s。/ K+ L2 ~8 h; I) W
(4)分化液洗15s。
( `/ z# _5 {$ {; l6 [& k6 t(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
; h" ?. h, ]& R/ k  T4 P+ H2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
* Y* R0 S: {/ l, J8 h以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成4 E7 p  Y# _$ k- I
油红O染色法步骤：- _9 b. Q8 V1 y: x, J5 Y7 i& J) n( @' {
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;- T8 D1 Z1 W& g3 _, }
(2)4%多聚甲醛固定15 min;
* r0 k3 [3 g" z# z9 {(3)PBS漂洗两次，每次5min;
5 r+ H6 N5 \; t% |3 O, \" E(4)入60%异丙醇漂洗。1 s" k' P% C9 o- l5 S
(5)入油红O染色15分钟。
7 U9 L( _8 K. l6 O! u% ?4 v2 rDevil60%异丙醇漂洗。% V/ a0 z' A' F5 ~% h7 G
; \: |# P* p1 Y1 B' t: b2 M9 v
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
4 A  [+ u) g4 U/ M以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
5 o0 S; i% i) G参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC$ u% g. o7 q5 c1 `
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
; w4 v* ~$ {" E+ r1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
* S9 E4 K. q) [2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。4 Q; A7 X& A0 H3 u  j) S( ]
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。  O4 s4 M7 V. G7 G' Y7 i
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。1 C0 U6 U6 b  f/ `+ J6 _- Y6 k
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
$ k1 B: F1 i5 j: D8 r6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
3 N) m6 |+ t& j3 R' R, G& x' |7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
( D6 Q8 v# O. k' b7 t, T8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
& W% }2 b2 P+ Y) p6 d! \9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。" u8 x, o; p6 M: }8 V
二、诱导分化实验：
: \. i1 e4 f: ~& T5 |取PP6进行诱导，采用两种方法：
. x/ j$ J* v: X( L
# s7 b6 e4 M( [1、共培养诱导：
, F4 H: h+ S8 a' }1 J细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
/ ]2 ]: \( b. N另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
6 [2 X! G2 Y0 |9 P3 `( E5 J( Y/ U; f4 I2、直接诱导：9 X! S  `- d( u) F8 e, V
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
- X! a# H. l+ G' V. ]( k; {同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。# t6 H$ l) D  R) J  B* `
" E! O3 Y7 D2 W
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG/ Q. a  v3 F' \

: U- t7 o. _' O4 ]7 M# `" w$ f! ^9 d) d9 M+ X* o3 I3 x5 K
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
" f1 Q* |" x7 F! H' o+ ~6 Q细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
2 q+ Q3 Q+ M1 l& {( XGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞6 L" [" H* r* G% L1 m0 j
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
# |. j/ J, r# y/ b
) O& R) _1 I) k- x  w1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
! }# |9 n% ]2 K1 P) V
9 R# p6 E5 R8 Z3 O- w2 g. ]! e8 I2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
5 ^& {1 U' y8 P# L! o2 P9 S( U
8 \6 n" O. W5 S& H3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。4 m! q6 U  y( k1 z' ]) Q% b( |

/ g/ [) Q) l0 l% V8 _9 d4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
8 b+ u0 C2 P8 k
/ {& ]0 H5 Z  g3 F5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。" `6 M6 C, S4 W, g
; w- ]! [; ~0 ?' f
参考文献：
8 N9 ?, ^& ?7 Y  t5 Q  b2 L1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.$ t" d7 G+ b9 s3 r0 l4 s2 h! u
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl) h+ t5 L# }/ o" f4 D
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化# i9 ?( ]8 ^* I' z; M7 a* T* q; s
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。) c; ~6 N& n7 _3 d+ g; W. b
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
. p7 d+ K2 D2 s$ l  B3 m* r诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。3 p* t- t% y/ a* G7 @
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化
4 X! Y3 [0 S) f1 b; @诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
" |* A/ R" z1 W- p) F1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化7 Q$ E  ~$ x; a
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。: D2 ?1 |+ j6 U# ^0 j) M
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
  j) p  J- [8 s7 v* ^诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。! O; j  r0 q, w  g* A
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化/ ^0 l3 o  K9 K; `+ J& b9 C6 X; V
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化3 C, f5 w* h6 y& x* Q1 }* g
诱导剂主要有5-氮胞苷。
- d* k4 D" X: V: c2 P; e1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
$ w2 `4 y' W* F; v( r6 V  H诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。