MSC诱导分化专题

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胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化, _5 k+ ~1 g' l1 f# ^. D( ?! \, p, l
1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。  G* \! Q  }( |" G5 a
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。3 P  H- a- K- Y1 X$ q
3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：1 @) C% U" L0 k0 h/ h
一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；
2 p/ z) K1 \0 O/ t+ a0 q二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。& N7 V: u* y, P" o2 T( l9 a: x& i
37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。( ^, X  `( p) w# j9 T% y
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。' ]$ w3 D/ m+ K: |
5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。
2 R/ _+ n) \, e+ [/ T" M7 k6 e) d3 ^; \' U) E
参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.( E0 [" m% z' K
Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

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deathdriver) G, Q* |" b% b  \1 \
我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：! a. d7 P0 M* E& }/ F$ p4 Y$ j
Osteogenic differentiation." }& Y  |- v& J! e1 y# N
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.- [# f; g# e8 s$ X% m# {; ~# ~
Adipogenic differentiation.$ h' c: V5 W( l  m( r
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.' _$ i9 r5 R9 R0 [5 N1 X. P1 G+ B
endothelial differentiation of ADAS cells.- z4 L. N' h9 s! S7 I! I6 {( E
To analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

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MSCs向神经细胞的定向诱导分化
) `5 U5 N( l/ ]( i7 T, ?  ZMSCs向神经细胞的定向诱导分化
; A% Z8 O+ S) x5 x- A8 o
) w4 z) K6 d2 l: e" f$ z6 I( K一 MSCs的培养和纯化
5 l1 j0 F) B  N6 q5 \9 Q二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化( p- H9 `6 q6 E1 D6 C
传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。6 H" z6 U% h& o, N6 r: s' i+ Y5 I
三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定- P1 `) m: [% m0 E/ _
免疫荧光法详细步骤如下: K) o, {2 O9 Z' `  @) f" {
①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;
, ^& s6 k+ B/ B7 R6 F2 I' ]②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；6 c) i! T3 Q) s7 b2 D, K7 t
③用0.4%Trixton-100透化15min。
3 ~" n7 N, T. c4 B/ m* s* l④10%BSA封闭1小时。
4 K' h  _  i8 p7 P" D, U% O⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。
2 @/ }8 |2 u) W8 x: L7 N, w⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。: P0 |( c) f' ^5 {  i* [# c
⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。% v  h" |) U# i( B8 j" _& D7 X
⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

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贡献一下我的向造血分化的培养体系：# E- t# i2 \4 G% f: C3 C
造血干细胞的诱导培养$ x& t8 v% C2 _5 f) }. D5 l  V
试剂：
: i: Q/ [) [& C# b6 v5 x2 N8 e1.  淋巴细胞分离液
% @2 h) U3 j, }- }( j' T! QNaCl  4g
  V! a$ i& G* @& @KCl  0.1g7 |) W# ?/ c$ v. ]/ \1 y
KH2PO4  0.1g
9 c& c) P. l$ _7 J, kNa2HPO4-12H2O  1.425g
+ I  _* U0 W5 f& |) d2.  PBS 500ml  X! v9 l: o/ A5 ?) L* C5 ]1 W/ R

/ Q& b( e/ ^/ g' J0 A; ^3.  进口胎牛血清
% O* ^) m( c; D( \; x1 I4.  IMDM培养基
5 p+ j1 n; I: D7 ]7 H5 P5.  2.7％甲基纤维素- g( F: R# n6 L4 N! x
  配制方法一" z6 W! K. }/ @5 N
1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。7 Z" V% J# C; q" @3 v7 W4 L# ]) R0 B
2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。
* e/ u1 j! N* _3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。- h$ l# V$ ~* j0 h  i7 ?
4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。
7 A1 n+ ?. ~6 Z: x! G5)加双倍浓度培养液125ml。8 ~/ o% Y1 s- ^+ G* O* M
6)加10％NaHC03若干调节pH至7  \" E2 _" J% N! e7 u8 r( O1 S
7)分装若干小瓶备用。
+ R2 {# l$ i" F8 ?7 G5 \* y+ ~  配制方法二（多选此方法）3 ?4 H/ R* F8 ?5 `- L2 v
1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。. I2 Z5 v5 ?6 T- E. p7 F  P/ f
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。/ a' i$ N9 l- Y0 _1 Y; I1 B
3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。
/ v0 [% c- Y6 O: p/ k2 G1 p4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。/ j+ d+ i: N6 Y3 ]# [0 J
5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。
0 B( X$ W. ?, h& e$ a$ C, G( Y3 b6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。7 l) T" U) p$ i
6.  牛血清白蛋白组份V
6 n3 x: P$ i4 w牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。% M$ ], p& n* }- Z( h- ~) X
(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。
$ M4 s% ~2 O: a# m/ c9 o- t(2)配制步骤
2 ~5 T7 \3 \* n5 E* Q, \/ a1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。% N# _5 a" s& C& ~; i. U( U6 Q
2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。
7 v5 M* F. v; Q$ G! s3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。9 _5 p" ?0 X& L4 V2 w) r6 H
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。
# ?: N9 d# O) S* a3 e* v# J5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。6 |7 v1 d& D1 h( j" l4 s' a
7.  β－巯基乙醇：1000×
% P# U% v7 C9 s# g2 p3 w' U8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml
; a  z$ S+ L8 H; f: `/ i) N9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln4 V1 n7 Z4 l) v: Y, l; f
10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
6 ?' E- S0 _* j5 G; Z# T" `10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃) U) Q% I: D# z1 v& `/ ?- V
11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）
8 T& i5 F% |7 N# o1 n$ s1 z12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml6 ^- i: K9 @2 G7 f/ c
13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml& f6 a& d; ]: u+ U0 k5 K& b
14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
7 a  Y  f' _3 x) Q+ B
. f6 N0 v9 L( q! {( d0 N( i6 m细胞因子的配制
2 w& W/ N" ]7 |0 e
8 D5 m. l) u1 Q. A8 i  j% x. i( s% E6 r细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度
* p2 q; |' W% IIL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml
: H& D: _: f& u3 v4 _4 J+ `3 DIL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml
2 d2 f& p; g6 w) zSCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml
% F6 t' \; V/ [1 d% iEPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
- _4 F* d, z7 u. n( {G-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml! K' d- M: b# p" u& }  X
4 d7 x# i6 b# M8 j$ ], v/ {6 {
IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度
4 j; l1 M  z1 w4 H/ j9 _0 }
. b. ~% X. G0 C' s# F( V" o" I( ^IMDM培养基  30％) r! H$ }, B& T  p. @! n9 }" K
进口胎牛血清  30％
9 n: J- m% J& o4 u' \* L3 ?甲基纤维素  0.81％
* Z" Q2 R& o1 m4 G牛血清白蛋白组份V  1％
6 N* @, R* v0 e7 z# mβ－巯基乙醇  0.1mM# Q( l2 i5 |' U+ B! v
青霉素  60mg/ml
6 C) ?% D3 r) [( v6 a链霉素  100mg/l
" O) P9 y. Z* u- ]* x$ m  c* CIL-3  2ng/ml
$ \# ]; c! G5 o4 BIL-6  20ng/ml
9 A& I. ^: T. ]SCF  100 ng/ml
! h$ B7 N5 |+ R, s% J4 i' sEPO  2U/ml
; R5 Q! j* X5 R6 X( K- lG-CSF  10ng/ml
, J5 C2 W1 l1 @  A5 \8 S7 VGln  2mM
1 K4 n. |3 [6 \0 v$ D
! p* C0 ^/ \& `% m  E" z诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）
$ l& B% T& P: {9 ]
6 c7 B# c4 M( y向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导
2 d- n! i' ?7 [$ f7 UIMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml
7 e, {( I' G- q进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml
0 b8 F/ v1 {: C- P7 F10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml6 ]: T2 N7 W8 x' }) n
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl
8 J" A# M( Z7 y. }& ~% zIL-3  5μl  5μl  5μl
* v1 g0 ~; L$ A- b0 y9 ?SCF  5μl  5μl  5μl- e: J. `) u0 \* X: S8 z
EPO   20μl     . R8 N! A3 e6 x! M9 g8 u3 R% N
IL-6     5μl  
$ G( M% d. W! |$ eG-CSF        5μl
5 T2 ]' \! Q% f9 w5 C3 k100×Gln  50μl  50μl  50μl9 M1 j& g; Q; a' v/ Z6 m
500×双抗  10μl  10μl  10μl5 n; `9 M) X7 W2 e/ A, j! G$ o
2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

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骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养! c/ i! C" i) \; d+ d, U- p- I
1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以# e; m7 N0 E9 ^% A& g4 E. o
10 5／ml接种传代。
# y3 z1 b2 e+ \% z$ C9 w- H) c% P2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

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成肌诱导
( h3 z, p( D# S& N1 e, E% v" ?2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。
6 y$ j' Z$ E5 x3 X# `' ^' \4 H& G3 \. d! ]+ C, }% c
内皮诱导
0 K# h) |  D* L6 U* f  ^+ {  g- }( v24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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脐血干细胞向软骨细胞诱导分化
- L  W2 J# d% \, Y1 m' {选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。
1 s' r4 n* l  O% @不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

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羊水来源干细胞诱导分化
* q7 b+ h1 Q5 a. S& M$ M! @1、羊水来源间充质干细胞1 d; U' k1 y, L  d0 V
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
; M: }4 s. r) H2 Y* L. N地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞
! o! C, h% I! `' E成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞& P9 `9 X  G  F" C
3 q0 k( W, ~$ e
2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）
3 x  v0 X1 J3 I. C地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞/ S+ l+ ~& f1 B
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
2 M4 G5 y/ k6 J# v0 y地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞
8 x: l  a# B1 }+ n& P- ybFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。
4 ~* j8 b8 T$ w2 Y# a" G
9 L' K! m4 R" h- o, p% f# b3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells
9 m+ y; t; H6 y2 ~8 |) {9 ~地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
% u* r6 N  h5 m5 u& a地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
' D4 _- O5 z7 d2 q3 {5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞
! l! \$ o. Z3 I. {内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞
" A& P8 R% {9 _! o% }. p: i) T二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
& g8 a# X6 u5 _+ b二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞
+ w: _% Z# [; }  e# r) B
  K2 g% I' B' G# N. a( J! U参考文献：
1 H/ `( z; V  o1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.$ S( P/ p7 T* D* a& E, \5 x4 ^+ w
2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.
9 O! H2 D8 y* B+ W+ H3 m3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

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dfe77 战友辛苦了，这些很有用。
( ^4 [+ E9 _. k9 V+ k4 ]; Z
4 K. L; M6 U" [1 f- ]& I如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

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