MSC诱导分化专题

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胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化6 t0 \# m) c4 K$ O& O
1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。3 ^5 n" b0 |1 I& O4 q* f
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。
, n: M" C3 t* B8 u& Q3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：
3 c! c! F8 Q8 Y* \& ^一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；
, r! v- B  s! C, N- \% \% K二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。
' }; G/ X3 n9 D; d- G. x37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。5 A2 u$ D' m* d' z9 R* j. L
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。
" E3 O/ w- L) t  r5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。8 s5 y* @) S$ f( T. Z
8 V2 }7 K0 H8 O& ~
参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.
9 N! s) f# |, A$ A+ EBiochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

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deathdriver+ `; v" ]- Z$ _/ C1 y  _
我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：
  ?) E4 W: w; W; SOsteogenic differentiation.- i6 W5 @$ S5 f1 `
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.8 ?3 M& |$ ^) C" K4 e$ A( E) E
Adipogenic differentiation.9 T2 s. [5 M: o; W0 \
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.
% W6 e* ~" i9 W/ A7 U5 ^endothelial differentiation of ADAS cells.% M4 ]- Q/ H# F( ?6 G1 |) k% O) K
To analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

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MSCs向神经细胞的定向诱导分化- g- Y7 _" n2 G% `1 e
MSCs向神经细胞的定向诱导分化
; B6 K, X8 s9 V: X4 J: \
2 o6 V; d6 Q# h" p9 X2 q一 MSCs的培养和纯化
( T7 |5 w% q. b' u0 f& [二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化
0 A6 r1 D# m6 Z7 h$ C' @! G传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。
% g: h! \% b- J, ~# A三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定& i& E2 N" X+ n
免疫荧光法详细步骤如下- a( _/ @  l, S# h/ x
①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;
$ q) Z& U- b- S( Q/ a! I' m②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
. P9 J$ y' i( Z. Y; B. N/ {③用0.4%Trixton-100透化15min。
, v! {/ F, b: x. L& }3 {④10%BSA封闭1小时。( G# c& X. e7 U1 p1 d( Z
⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。" _$ ^" W2 s+ J& v
⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。, L- I0 l+ R  q5 w
⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。3 }7 V8 f7 y0 l/ a( q
⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

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贡献一下我的向造血分化的培养体系：
+ A% G+ Q0 z5 A5 r造血干细胞的诱导培养4 \' `6 U9 q, x! K
试剂：; U- X6 i& j" w; I
1.  淋巴细胞分离液
$ A4 @9 V, s3 U6 H, CNaCl  4g: s; g* V' h/ t4 T
KCl  0.1g
6 C; M9 ]5 {; s% `" V, lKH2PO4  0.1g
( D; d% ]# d7 I! X  }Na2HPO4-12H2O  1.425g
( ~+ {' |% b$ h: T7 q' I. M5 R2.  PBS 500ml
% e  v; }5 ]6 F# m( e& E- l1 M7 P; U0 _! @8 B) a+ S
3.  进口胎牛血清
: x6 u5 m% j8 m0 b! H, t1 }4.  IMDM培养基
2 C  F2 U% H# x: Y2 y5.  2.7％甲基纤维素1 f: S6 @: B$ R+ H; K# @
  配制方法一
  |& p: G# t0 d& }& b& t) E1 M1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。
7 K& m3 y, q# i; ?& D$ u7 H# J" `* J2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。
: j( l1 r7 l5 {3 _* U$ o# f3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。! p' y  _- Y* [4 x6 N
4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。$ D# q8 \. z  a8 \% p# q/ E' T
5)加双倍浓度培养液125ml。, H: X2 B- v2 n" b3 X
6)加10％NaHC03若干调节pH至7
0 p8 x. B) u1 H4 I7)分装若干小瓶备用。
! n9 ~& o$ `5 n7 ?* p6 [  配制方法二（多选此方法）) G% I. A) @! }
1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。8 Q: M  B" t3 b) q3 b) |
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。
0 V2 {" Q' t$ ^1 z3 h3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。
2 H8 ?9 y6 Z+ i. P4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。
# I/ `/ K  e! I) \5 |& N5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。* Q  C: K9 b& [6 m
6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。7 w. v7 m/ m8 O9 A
6.  牛血清白蛋白组份V2 d/ c0 r. h" X" A6 x2 L
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。
) i* B6 g0 G1 ]4 {# p6 o1 _  k(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。- W, q% v  |* o6 f/ Y2 O
(2)配制步骤
. @5 t8 b& M( C* u3 ]" F! }% ^1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。
- z( S1 n' R2 \2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。1 }+ \  W8 p/ L2 V- \: t
3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。9 n+ h( V" _- x
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。
( I+ k. Y* f' o9 n0 [1 |! h5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。
% \% Z0 @- P1 T1 e; q, \' ?7.  β－巯基乙醇：1000×9 w, Z3 h6 q. J% I
8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml
2 h+ k, X# x$ n2 m' a9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln: ^7 L1 Z3 h. p( L0 i9 H7 I, C
10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml6 w3 Y% U7 c+ ~* f; W( a& w
10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃5 {% Y; K. N" I& Y7 a. T4 h$ }- F
11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）+ X( O8 d9 E; J0 P
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
, @* v; ^  z3 {) t% o( @13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml
2 j  M) [0 M) y* u1 l9 N$ M2 w14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml! M: \( C1 r: d2 ~/ X; R4 _  n
) Z- Z) v0 \: j& o' {3 S
细胞因子的配制
$ K/ c1 `; a, u( P$ ]& I: @; H
7 ]. U$ R, r2 }- |细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度/ r2 U9 k: f/ T
IL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml
( ^" |  R5 g. u4 L9 IIL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml
1 P' o- C$ i; ?, x5 }# ySCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml8 F* i9 b7 a) m5 X+ G$ E- f2 a! u
EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
  g9 q8 J  g& M0 r% p8 z' h- }* ?7 UG-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml( _( D4 z4 W& H% p- w4 t
$ Z" G5 Y* h; r0 m
IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度; J. Q0 J5 u; g; h
: Y+ n; j+ z; a7 h: d2 X
IMDM培养基  30％
( N7 [5 _+ {( ]9 Q0 J4 y  H进口胎牛血清  30％3 @, g# c0 ], K$ v
甲基纤维素  0.81％5 J$ o& Y  e$ `0 V+ k6 E
牛血清白蛋白组份V  1％
9 q" N4 z1 b5 Y( f3 u$ c5 dβ－巯基乙醇  0.1mM* I% f! |# j0 a4 f
青霉素  60mg/ml. F5 G, l6 |$ x/ D( ~
链霉素  100mg/l
6 h7 M) p9 d# I8 [( H+ z* r( HIL-3  2ng/ml: x; z: v9 \$ X* s% V
IL-6  20ng/ml
2 Z* R5 @/ D$ L) T' T# t6 HSCF  100 ng/ml
* h/ S/ P, m- d! Z* P4 k. BEPO  2U/ml  q6 Q2 _: b" z& Y
G-CSF  10ng/ml
/ j3 Q, s1 X, K/ u8 _6 E( FGln  2mM" M# |( O& g: C3 X  \) [6 a

- B$ s; V. s9 ~. L. N3 b& i诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）6 w2 [# c/ F" i+ R" v/ E% Z7 |! e

. q6 u' C2 Z/ u( F8 S/ H* t1 l向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导2 w$ n, C0 A4 S. C2 \8 [
IMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml4 j3 @2 X! ~; I+ Y& e
进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml; K+ W; R# `/ M# S
10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml% D, D% S* D  ]; X& i4 A
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl
+ A: o" d5 R( q* c" ]9 e2 SIL-3  5μl  5μl  5μl- ?1 ]+ W& _* t: H& `+ U
SCF  5μl  5μl  5μl3 O. t) G( N1 B- Y3 Y& b, j6 K
EPO   20μl     
( I5 C9 E, m+ s' J- JIL-6     5μl  2 P( Y; Q# X, D2 i0 j* C
G-CSF        5μl
! y/ x! S) K% j1 S' y100×Gln  50μl  50μl  50μl4 u6 X8 f: f2 _
500×双抗  10μl  10μl  10μl. @! C; o" O1 p
2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

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骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养9 {% Z/ D# x  o/ h2 |6 T: w- [5 V
1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以, p4 n1 Z% z4 y' g+ Q. K8 O5 l6 l% c
10 5／ml接种传代。7 m% l5 d5 B' |" W- L* ~
2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

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成肌诱导
- Z4 W9 p' K6 F2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。1 a0 V( I* i4 k
( \) y' H+ g! A3 S& v) a9 K
内皮诱导
4 m* K; X4 N$ @2 q9 w: w6 v24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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脐血干细胞向软骨细胞诱导分化
7 W- k2 [. ~# n$ P% J; E: U选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。
6 Y: P/ g* o% O. B1 y不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

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羊水来源干细胞诱导分化
6 z" x+ i! H% h0 M  e1、羊水来源间充质干细胞& t1 l/ \# B  w8 @5 y0 D+ O5 Y
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞) a) C& Q( L1 p( s6 z
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞1 s3 C% R, n* D( {1 n3 g( y
成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞
6 s6 `9 B, D' `' k1 Q0 b0 z$ O2 O
9 ?2 `% }9 n7 o7 w1 s2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）- P! `# b. u  O0 f
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞& f3 @3 V1 A3 q4 M# ?  {
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
7 X& k& H8 r- o& g* I8 m8 g地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞! r. l$ [* ~( s5 W1 d+ s$ M
bFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。
2 a/ h( W. ^# d* `: u
" `, l) |* [0 t, ]3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells
: A6 K6 {. [8 M5 G地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞2 s3 V7 g3 B2 q; _+ b3 F
地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞
: u" N) h4 s% ?3 m5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞
! m. `* `7 u" i2 ?内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞
$ @/ M: P) C8 T1 C$ b二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
3 J* a9 x8 n; I, }, t二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞! o/ ?) P2 @6 G

+ l  S$ r! J1 T  D. J* Z* f; {参考文献：
0 M  j) f5 `3 R; [1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.7 v: I, A# P' ]% [$ ?
2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.3 {7 {7 f% ?# x$ t
3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

yuheng

dfe77 战友辛苦了，这些很有用。
4 H3 @( J, |/ O2 `9 o- @  v
0 u3 J# e+ Z7 r3 W如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

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