MSC诱导分化专题

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胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化
9 g7 z0 V* q. D1 I1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。! v, l* M3 Q& I  a) v/ L  s# q
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。5 v9 ]2 D5 C) Y0 i' g4 B
3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：# y3 q- G2 L  _! C* ~" ^$ `
一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；
' \9 p5 c9 _+ X( Q9 _, S二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。6 T( D7 O  F7 k
37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。' K9 T, u# b; @1 m  s
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。" P' q9 M4 s0 J  S3 Y* [; Q
5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。2 S- e; t( o- o0 `) o( y

3 I5 l/ v# J* B8 W6 V参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.; {4 j, o, Y! d1 K% U, V
Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

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deathdriver
/ P* y  s  I( j6 N+ I我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：+ q4 h% b/ B4 q( e
Osteogenic differentiation.6 m7 d; c; I! e% j
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation./ B) f# K( W8 p* A% B
Adipogenic differentiation.! J* F( O6 o) i
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.
! Y- Q$ y& S5 R; c  vendothelial differentiation of ADAS cells.
  z) K1 f# y) g0 RTo analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

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MSCs向神经细胞的定向诱导分化9 P" @& U7 e" ^- `7 k
MSCs向神经细胞的定向诱导分化
: _0 m- j/ r% i" B! @5 j, N2 J2 n% D- \
9 U$ o. |" n/ t+ A一 MSCs的培养和纯化- z1 ?1 j$ j6 I  d+ s, o# r3 L
二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化- }! h* R/ r- ]& u# h) e2 q
传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。$ b6 X, Z; c- y9 h9 i1 \# O  @
三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定
, E# Z1 _& m9 }6 a免疫荧光法详细步骤如下
$ R  d2 K; i5 h! M9 |9 S①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;0 ~" c! d, R$ B1 X- S& }
②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
8 P2 A& o9 ~5 C: z5 d0 _③用0.4%Trixton-100透化15min。
3 a9 S: ?7 \6 |+ L4 w7 ^. M0 O④10%BSA封闭1小时。+ u5 l/ q: I3 W2 j6 q
⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。7 H: m# F/ p0 N* D& m! m# g( N
⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。9 K/ z$ D" I# G; N/ L. |
⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。
8 {4 B! V. J- X: u⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

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贡献一下我的向造血分化的培养体系：5 R3 L$ O  ?6 j& U; |+ X' E
造血干细胞的诱导培养/ S. o. r# d  n% f9 x$ m9 v
试剂：
' M  c2 A- ]) @1 W( Y7 I0 u+ E1.  淋巴细胞分离液
9 G  ~8 i( ~. F8 b3 U/ l8 CNaCl  4g
4 [& }, P. p+ K* u7 ~KCl  0.1g
, J  s  R& S+ V0 y3 `2 _KH2PO4  0.1g8 A' U1 I/ s3 K$ N. s7 o
Na2HPO4-12H2O  1.425g
0 `! K9 T+ Z/ K) n( p2 y7 d2.  PBS 500ml
! x! s' z2 O, e0 v8 j1 i( N* s, P9 A9 m3 E
3.  进口胎牛血清
. u% Q" T0 e& M3 j* p* \4.  IMDM培养基" E0 I. y3 G( w% @
5.  2.7％甲基纤维素
  j7 ]5 t6 {; K9 ]$ G- m  配制方法一
" O3 k0 ]; \9 t8 ^1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。! }* g- z% d; H
2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。+ l  d! v7 m3 y3 c- H% V
3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。
3 ?6 l, c  w9 p7 R: I. Q6 S# Q4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。
, U9 B: G- v! Y; p+ T' ~( t- D5)加双倍浓度培养液125ml。. t' L( _. K4 Y% t/ l) \: l+ a
6)加10％NaHC03若干调节pH至7
4 l/ \# {( I1 o, i9 _7)分装若干小瓶备用。8 N/ r3 k) U9 N) u/ }7 u
  配制方法二（多选此方法）
" x8 u0 B6 G: n/ T1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。
2 E" h) Y# N0 x3 @) [! [% U3 F2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。
, a9 Q) W/ G  K  x/ v" X$ q- d: s3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。3 ~4 C- g9 p( E# }
4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。) N0 M, J7 k# T$ b" T; N  F
5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。# c7 m1 N& f3 @. L
6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。5 L, U9 _& p- e9 ~/ x  n5 {7 V3 ?# V
6.  牛血清白蛋白组份V. g0 O" U/ }' I2 Y% s" b% `
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。
' X- A% w* a/ y' \3 g3 Z% e1 d(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。' U+ k/ G2 O8 e0 N
(2)配制步骤% H8 }1 J- L, n. J+ h7 ^) ~
1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。( W. l9 c# ~) `( m/ k* }
2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。& J* d" r! \* ~" f( g
3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。  U+ Q% i, J$ q' B- r2 g% K' B
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。
) l# x7 j2 i$ o, t  h$ d3 {* o, c0 G5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。
9 X9 |  a$ o* s4 a3 V6 J! D7.  β－巯基乙醇：1000×2 [! G( k* n: ?8 L0 O7 X# G4 L
8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml
  S5 n* |# Z( @& N: l3 x  L$ l9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln
: h6 o* [7 X! D: p! m, |* D5 \1 A  y$ Z10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
7 O9 f5 }! p- {2 g2 x/ y% D0 }10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃7 a2 p8 `. R) Q& y
11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）- l  ?) |0 O! _! X3 p
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
& l" F+ v3 n2 \7 H. s13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml5 [  S$ d; m) d4 r  l
14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml4 J# U6 A2 Z, r

5 X: x0 D3 R7 J# Q& c& i3 C细胞因子的配制
' e* o" L' E/ T2 n( w
- W3 O, t. \" r5 z+ k- A细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度; ~5 s4 E  ]( y/ v1 ]
IL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml
9 R! B0 A: w2 F5 [IL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml" c" t3 Q7 ?$ J
SCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml
! W4 J9 X7 ]5 M- M/ _EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
4 e0 X) R% Q/ _6 D9 W& R" TG-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml8 F  S" o# P+ h2 C2 [, L' a# H4 p# d

) X- v) q3 L! S; O5 {8 T% YIMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度
7 h2 A: U* ?: ^" ?+ r. O* c( j5 X* V) I3 Q5 x$ H7 @
IMDM培养基  30％$ F8 o) j1 G. P3 r$ A4 l
进口胎牛血清  30％" j6 l# ~$ Y5 f8 N: e1 s
甲基纤维素  0.81％
! U, ?# P# L9 R6 b8 g& c" k9 T; o* U牛血清白蛋白组份V  1％
, I0 R9 f. q9 v3 `. v8 O) }β－巯基乙醇  0.1mM: A* k3 d" r- w
青霉素  60mg/ml
* I+ d2 z1 i. V% O+ m链霉素  100mg/l
1 u; K% R$ b2 }2 N2 ~, H3 v+ rIL-3  2ng/ml8 g6 ]1 k4 Z/ z1 d% ?
IL-6  20ng/ml3 P; I  b% W/ W' N9 }1 B9 ^$ _, I
SCF  100 ng/ml0 e; I; o( o4 I7 z
EPO  2U/ml2 b8 R" c  d: Y0 ^. F' I) Z
G-CSF  10ng/ml
6 m6 H5 {% E: C. Z* N  K* ~  `, _Gln  2mM( m! u8 a' D8 I0 M: x0 a

" r  |# Q! I1 U+ W* i: Y+ f诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）3 P6 I$ M' _3 X( K; M$ w
) R0 s8 V% ]( ^6 S6 W  J
向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导
/ `6 I3 n$ F8 W" Y: x# [. C/ ]8 v* sIMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml4 B6 D' ]3 ~; C9 n7 @# N# ~
进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml. w: c7 K- o8 N% G/ B* S' ^
10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml% G+ M2 |8 b$ e  g2 o* s
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl# m5 j' ]0 u4 n( `7 m
IL-3  5μl  5μl  5μl' T8 c4 O8 n$ n) b
SCF  5μl  5μl  5μl
7 u1 _) ~7 M( KEPO   20μl     ) c  Q8 C. C& o! w1 s
IL-6     5μl  
4 Q/ v! c' E" W9 a! QG-CSF        5μl/ Z$ _- I- C4 T1 W; U: m
100×Gln  50μl  50μl  50μl
& Q" i& p1 f7 i/ C500×双抗  10μl  10μl  10μl
5 P  k' o4 z$ H1 ?2 v/ w2 H2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

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骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养
( d4 M( H) z- _2 u/ ^; e1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以& F- K8 B3 V! M7 B/ g) \- a" S% f
10 5／ml接种传代。- w: v- E+ r; s: b
2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

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成肌诱导% X4 j5 o9 C% T& Z! V! _
2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。( ?% t8 P. }5 v$ C$ P
$ k1 n; Z: g1 ]0 k
内皮诱导' M& l$ Z4 w3 r+ c3 l. v/ p7 `+ D
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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脐血干细胞向软骨细胞诱导分化5 O9 N. O# W7 ]- @8 u
选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。2 B# f3 v( J5 N8 F0 }& O
不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

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羊水来源干细胞诱导分化6 ^' \, `! O, O( ?0 \$ |
1、羊水来源间充质干细胞
& b/ ]6 n8 \& }; t4 ^/ X7 w地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
' j3 M' l2 T! |地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞
! M# h; m& {. v) O4 ~成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞
( C) D/ P, s- p: k/ P: z0 v% B! E$ q) g" B( ?$ X" e0 B2 P
2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）
9 _3 l6 U' |, C1 G- J. k* Z地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
1 K) K% v! ^: @5 E地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞; d! b" b& q5 B$ w  A. r3 j# L
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞( d; ?4 K* X' g, q
bFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。
' v$ P0 j; S5 L4 g  _0 Q7 K9 m  `5 j$ |
) \- R( E4 j' o/ Y/ d8 Z- A1 c3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells/ @* S7 Q; i0 ]  _" q
地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
7 o  B( Q( t9 p" c地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞0 U7 Z( G# p0 \6 [+ X
5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞
% ?# s$ ]# z/ A5 w* v5 [内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞
) D+ Z, Y" ?8 F二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞3 H1 d- O9 S! F8 B3 s
二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞
0 N) z% y2 ^) m) I+ X" ?; c# d, z
% x9 b; K4 K3 c: l- P参考文献：; `4 ]& \: p- s. M# D; _7 f; Y
1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.
+ T! [" s6 j: h( ~2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.+ [. w5 J$ u) \3 Q/ _- g7 c- I7 o
3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

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dfe77 战友辛苦了，这些很有用。
* Z6 {$ Q8 x% I0 C# S; F' p* B
  v! q& p* o5 x; I- ]! g如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

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