细胞流式检测准备（直接标记一抗）

kgx1986

试剂准备6 Y0 X9 O# I7 j
1.准备荧光标记的一抗和同型对照抗体
. ]9 H1 I8 O9 h& |/ [) W% H2.细胞洗液：含有2%BSA（牛血清白蛋白）、0.1%叠丹化钠的PBS.
+ `" M: T; m) Y3 p3 w- j: Y3.固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）pH值一定要准确，否则会影响检测结果。
) k- ]  y; r. r: o操作方法
$ k5 G4 A8 z' m: q. \1. 每个样品取2支流式检测管，分别注明同型对照和待测，两管分别加入106-7/100μl个待侧细胞（若细胞浓度低或加入的细胞悬液较多，可1200转/每分钟，10分钟低温离心，弃上清，保证100μl被检样品）
8 }( B3 u$ ^/ [8 a2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。3 H- X3 W4 W. Z  _- \6 q' m
3. 4℃度孵育30分钟，加入细胞洗液，1200转/每分钟，10分钟低温离心，反复2次。5 s  i2 z& k& O) t0 D. ?
4. 去除上清，控干，加入固定液0.5ml,混匀。/ \* z5 u* {5 z( p2 h' V9 t9 }
5. 上机检测，先做同型对照，调整电压至阴性区范围，再测实验管即可。

mzyysmile

2. 我买的是100μg的规格包装，里面是干粉，可以溶解为2mg∕ml的溶液50μl，我想问的是：一抗的选择梯度1：20、50、100倍稀释是指50μl可以稀释为1000μl、2500μl、5000μl吗？使用时所加的30μl 是稀释后的抗体吗
1 d6 q8 U$ n% B/ A+ _7 g. [' M8 X5 b' d  X
抗体的浓度1：20 是指你有200 ul的细胞悬液，加10 ul的抗体。. `  K" S& y& M+ H" ~2 O
细胞悬液的浓度，我们选择的一般是1 million cells/ ml，甚至会更高，不过在做Flow analysis的时候，或降低细胞悬液的浓度的。6 K! }, j' |4 ~  w* f
其实抗体的浓度是针对细胞的数目相对而言的，说明书上一般会写1 million cells加。。。ul的抗体。
9 m# Y- W% F+ S, q所以，细胞悬液和抗体的浓度都是要你自己摸索的。

翅膀111

我记的抗体说明书上是写1ug可以和10的6次方个细胞反应，所以我一般按此比例加抗体。

kgx1986

* J8 B/ O, s5 I+ N6 C) S5 ^& y0 N& N# T, x
回复 mzyysmile 的帖子/ n2 [+ Z+ Y, U0 n0 ~& l+ A
1 o( g  D0 I  v6 _# ]( C0 i- Q
谢谢老师对我疑问的解答。. l& y0 V4 ?6 u" L) y$ M& [
对于第二个问题我想知道你的看法。没做过流式，渴望你对于我这个“问题少女”的傻问题能够耐心解答 。
/ B! [" C7 S& n是不是100μl待检细胞内加入30μl稀释后的抗体（即50μl抗体按照1：50稀释得到2500μl稀释后的抗体）？还是待检的样品有1500μl按照抗体：样本=1：50需要加入抗体30μl？你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

mzyysmile

对于你的第一个问题，不推荐用no labeling 做negative control
4 `& }6 c! O& I相同voltage下，用No labeling做gating位置明显比用Isotype control做gating的位置靠前很多。。。。所以用No labeling的话，得出的positive Cell percentage比实际的要多很多。。。

kgx1986

回复 zxcv12345 的帖子
. @! n+ u; `5 h& w. _! E! u; [( q+ G
" u) S+ k9 z0 P2 I* U$ ^谢谢老师，我的理解错了。我之前没做过流式，一直以为的是：每个流式管里的细胞容积是100μl，这100μl里面含有细胞量是10（6-7次方），也就是说细胞浓度是10（7-8次方）∕ml。
' x% ^6 p# w9 r" m6 E  m! ?我想问下你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

zxcv12345

30μl是他的抗体的稀释倍数所需的抗体。你的要按你的抗体使用说明书稀释。如果需优化，做选择几个梯度

kgx1986

回复 zxcv12345 的帖子
: w" ^: b1 x0 j( v+ l* v  z9 Y/ S& X: L
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。3 P1 s- L  k2 p# K7 R' w
2 s# T8 x# @' s
这一条中我的理解是：试验管和对照管内有细胞100μl ，50μl 的抗体按照一定比例稀释后，各取30μl加入试验管和对照管混匀，然后接下一步。1 d2 J- l7 ?! P- h) b) Q- B
  u! S% r7 L0 U5 O4 O2 U- p; Y
我觉得你的理解是，抗体不稀释，如果取一定容积的细胞的话，那么所需抗体容积是细胞容积的1∕20,1∕50,1∕100。操作说明中的“30μl”就没什么作用了。

kgx1986

回复 zxcv12345 的帖子# K* l! R+ z3 E' D

" A1 G9 V9 W: k. P1 P9 @* |感谢呀，感谢

zxcv12345

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% B+ B6 r* u" t- p7 w
问题1：可以
+ `! `0 K) h% R% r  r' y问题2：算法没错，但50ul是储存液，不能全部直接稀释，不利于保存。比如你的用FACS的细胞是在1ml，你要1：100稀释，加入10ul进入1ml细胞混匀