细胞流式检测准备（直接标记一抗）

kgx1986

试剂准备
3 P/ o7 J5 m, J$ [( S% k1.准备荧光标记的一抗和同型对照抗体
6 T, y) Z8 E% ?& S2.细胞洗液：含有2%BSA（牛血清白蛋白）、0.1%叠丹化钠的PBS.
* e$ _, _1 ?8 ^+ ?$ c3.固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）pH值一定要准确，否则会影响检测结果。
; |, B1 H/ P/ [+ C# d1 {6 O操作方法  e6 F9 y$ G5 ?& O
1. 每个样品取2支流式检测管，分别注明同型对照和待测，两管分别加入106-7/100μl个待侧细胞（若细胞浓度低或加入的细胞悬液较多，可1200转/每分钟，10分钟低温离心，弃上清，保证100μl被检样品）. \; o$ z5 n) W. d% x) Z1 I; E
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。4 A/ e3 f6 ?% \
3. 4℃度孵育30分钟，加入细胞洗液，1200转/每分钟，10分钟低温离心，反复2次。
# F: g5 ^3 G) z9 E; X4. 去除上清，控干，加入固定液0.5ml,混匀。8 t/ |, K% P5 b9 t% m
5. 上机检测，先做同型对照，调整电压至阴性区范围，再测实验管即可。

kgx1986

我有两个问题：0 _" }2 X) o  I8 Q7 _/ c1 b6 h
    1、可否用待测细胞加PBS做阴性对照？  k% o; Y( u' S. b! t. Q" U
    2、我买的是100μg的规格包装，里面是干粉，可以溶解为2mg∕ml的溶液50μl，我想问的是：一抗的选择梯度1：20、50、100倍稀释是指50μl可以稀释为1000μl、2500μl、5000μl吗？使用时所加的30μl 是稀释后的抗体吗？( t; H, U0 ~) ?1 z

! e7 M$ p( S5 Y做过流式的同学或者老师恳请给予指点！

zxcv12345

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" b4 T1 n' z& q3 G: c: O" C; c/ P0 w+ M* ]2 t6 p3 y# Q7 O& v
问题1：可以
- ~% m! P$ X' K问题2：算法没错，但50ul是储存液，不能全部直接稀释，不利于保存。比如你的用FACS的细胞是在1ml，你要1：100稀释，加入10ul进入1ml细胞混匀

kgx1986

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# F5 ?/ `$ u* g0 `
! [% ^. B$ d: R+ K感谢呀，感谢

kgx1986

回复 zxcv12345 的帖子6 n) ?3 i7 p  g$ K
, [* S* f8 |5 X3 R
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。
( W* `3 M/ d! I7 b% c5 M+ B$ z3 \% s0 [) k: W* j
这一条中我的理解是：试验管和对照管内有细胞100μl ，50μl 的抗体按照一定比例稀释后，各取30μl加入试验管和对照管混匀，然后接下一步。; x5 K( e2 a  k* S; I) r) g& a

1 i% D5 I$ x4 |$ k& d我觉得你的理解是，抗体不稀释，如果取一定容积的细胞的话，那么所需抗体容积是细胞容积的1∕20,1∕50,1∕100。操作说明中的“30μl”就没什么作用了。

zxcv12345

30μl是他的抗体的稀释倍数所需的抗体。你的要按你的抗体使用说明书稀释。如果需优化，做选择几个梯度

kgx1986

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/ X  s( I+ e* ?0 q; ?* G& Y0 G$ D4 o0 f& E
谢谢老师，我的理解错了。我之前没做过流式，一直以为的是：每个流式管里的细胞容积是100μl，这100μl里面含有细胞量是10（6-7次方），也就是说细胞浓度是10（7-8次方）∕ml。" [3 A) d8 ^: I6 z/ _
我想问下你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

mzyysmile

对于你的第一个问题，不推荐用no labeling 做negative control: r# W  s/ {- r* x
相同voltage下，用No labeling做gating位置明显比用Isotype control做gating的位置靠前很多。。。。所以用No labeling的话，得出的positive Cell percentage比实际的要多很多。。。

kgx1986

( r3 `$ q3 v9 V
( a) T4 M, r4 i- j
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3 `9 ^  s6 f* f0 q/ n# B
* c! M+ T( ?3 c' E谢谢老师对我疑问的解答。: I# h/ \7 D# o7 I
对于第二个问题我想知道你的看法。没做过流式，渴望你对于我这个“问题少女”的傻问题能够耐心解答 。7 \  j, e% E4 Y4 e6 z
是不是100μl待检细胞内加入30μl稀释后的抗体（即50μl抗体按照1：50稀释得到2500μl稀释后的抗体）？还是待检的样品有1500μl按照抗体：样本=1：50需要加入抗体30μl？你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

翅膀111

我记的抗体说明书上是写1ug可以和10的6次方个细胞反应，所以我一般按此比例加抗体。