细胞流式检测准备（直接标记一抗）

kgx1986

试剂准备
) @' b; f6 f6 ]! }" W1.准备荧光标记的一抗和同型对照抗体
! A$ W6 @% G2 h: v0 T! _2.细胞洗液：含有2%BSA（牛血清白蛋白）、0.1%叠丹化钠的PBS.
( {& E  A3 I0 J7 Z6 `* z3.固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）pH值一定要准确，否则会影响检测结果。( ]9 K0 @- M) R& F( G; h
操作方法/ e: q4 J$ H: P" `* F' S
1. 每个样品取2支流式检测管，分别注明同型对照和待测，两管分别加入106-7/100μl个待侧细胞（若细胞浓度低或加入的细胞悬液较多，可1200转/每分钟，10分钟低温离心，弃上清，保证100μl被检样品）4 I' Y3 v, M6 o; n
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。
6 t8 W+ M: I+ v$ T& x3. 4℃度孵育30分钟，加入细胞洗液，1200转/每分钟，10分钟低温离心，反复2次。  W% w* ^% k/ V# q: g
4. 去除上清，控干，加入固定液0.5ml,混匀。) K# k7 |, V3 j; y- @2 U8 U6 d
5. 上机检测，先做同型对照，调整电压至阴性区范围，再测实验管即可。

kgx1986

我有两个问题：
! X) A. ~" N7 [2 M' r% I( z    1、可否用待测细胞加PBS做阴性对照？
+ F3 ^# E5 N9 p: G1 h& ~    2、我买的是100μg的规格包装，里面是干粉，可以溶解为2mg∕ml的溶液50μl，我想问的是：一抗的选择梯度1：20、50、100倍稀释是指50μl可以稀释为1000μl、2500μl、5000μl吗？使用时所加的30μl 是稀释后的抗体吗？: N# q* z- ?8 l$ V' D
2 I& q. Z4 ]5 n
做过流式的同学或者老师恳请给予指点！

zxcv12345

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: h. r, A) C% g6 A- H1 W问题1：可以
4 ~7 ~- M+ y8 y问题2：算法没错，但50ul是储存液，不能全部直接稀释，不利于保存。比如你的用FACS的细胞是在1ml，你要1：100稀释，加入10ul进入1ml细胞混匀

kgx1986

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6 X/ Y" t$ j; G# R. |# Z
+ |: d1 e) m: L1 T1 Q$ h& Y4 a, P感谢呀，感谢

kgx1986

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2 `  V8 J7 ]' f. m8 J
! J' Q8 e6 o5 X# G/ ?2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。
" t( d3 C: p3 w) v/ x' m/ p4 Z; I* f: S
这一条中我的理解是：试验管和对照管内有细胞100μl ，50μl 的抗体按照一定比例稀释后，各取30μl加入试验管和对照管混匀，然后接下一步。& D- r, G6 v6 N2 o4 n7 t
2 e0 D0 E" a/ V. h4 Z- M! `
我觉得你的理解是，抗体不稀释，如果取一定容积的细胞的话，那么所需抗体容积是细胞容积的1∕20,1∕50,1∕100。操作说明中的“30μl”就没什么作用了。

zxcv12345

30μl是他的抗体的稀释倍数所需的抗体。你的要按你的抗体使用说明书稀释。如果需优化，做选择几个梯度

kgx1986

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9 [$ |9 y' ~& r
谢谢老师，我的理解错了。我之前没做过流式，一直以为的是：每个流式管里的细胞容积是100μl，这100μl里面含有细胞量是10（6-7次方），也就是说细胞浓度是10（7-8次方）∕ml。
+ t: u: n% Q# r2 s$ G+ H$ h9 _/ M我想问下你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

mzyysmile

对于你的第一个问题，不推荐用no labeling 做negative control! `$ h! B) t- a3 T  j6 w
相同voltage下，用No labeling做gating位置明显比用Isotype control做gating的位置靠前很多。。。。所以用No labeling的话，得出的positive Cell percentage比实际的要多很多。。。

kgx1986

* ^$ H7 N# L' [6 C8 c& Q% }9 D1 v2 z( u: }
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$ P& O0 a0 |: n9 ], _8 Q! m5 I& a. \( h" ?) C
谢谢老师对我疑问的解答。
8 L1 W9 j6 e7 @8 t7 s# s  {对于第二个问题我想知道你的看法。没做过流式，渴望你对于我这个“问题少女”的傻问题能够耐心解答 。6 Z! L+ o) ^& C9 K! @( W
是不是100μl待检细胞内加入30μl稀释后的抗体（即50μl抗体按照1：50稀释得到2500μl稀释后的抗体）？还是待检的样品有1500μl按照抗体：样本=1：50需要加入抗体30μl？你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

翅膀111

我记的抗体说明书上是写1ug可以和10的6次方个细胞反应，所以我一般按此比例加抗体。