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发表于 2010-9-2 18:23 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响 : O, O% u& W" o' o5 ]
庞劲松刘宝

文本内容预览：
表观遗传学与DNA甲基化/ m$ |( _# v# x4 a4 i: _5 s$ t
DNA甲基化作用% j+ E6 Y8 l+ k; z7 Y. @# }2 W
DNA的甲基化及其方式  z! \7 I4 q' [! G; R8 J" U
DNA甲基化的生物学意义
DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成2 U7 X0 v. `$ H; d
DNA胞嘧啶甲基化检测
检测方法：MSAP，bisulfite sequencing$ @( a5 M& N, c  o6 k
5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响; A0 V5 s9 c: @$ T4 G  L' h
实验目的
实验材料
仪器
试剂
实验方法
5’-氮胞苷处理水稻幼苗
植物基因组DNA的提取与纯化
基因组DNA酶切-连接接头. \+ V' p* |4 q. H
PCR扩增：预扩增，选择性扩增
PAGE电泳
预期实验结果# O4 k4 c4 f" w! W# ?5 R
注意事项与建议
思考题
参考文献3 j; F! P9 K" U# M# d
& s: b0 B  ^; y& n& C
表观遗传学：
不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。
表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。' l# M3 v; N4 t$ V( {1 C
表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。
DNA甲基化：6 l5 a& d  T' p( \' U# X5 M7 d, W
在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。2 z4 l- C) j- m' B' L  A2 Q& ~9 h1 a

DNA甲基化的方式) S0 t7 |. g, T; W4 c9 L
胞嘧啶甲基化

腺嘌呤甲基化% K: \! d5 j$ i
& V2 M4 P) Q: o, o5 K7 @
DNA甲基化的生物学意义* U( T* N: z  J$ ]
影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录

) Q2 a! |% S. K) C+ }
                              图3  甲基化与基因沉默. c+ F$ i2 _) ~2 `
参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态
提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型2 M2 u# a* T$ z# b4 N/ s

DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成& O: n( {( i$ k; b  R
* o2 B9 w% j5 K: }0 m  V
从头甲基化 (de novo methylation)
DNMT3a，DNMT3b
在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。

维持甲基化 (maintenance methylation)
Met1，DNMT1 # s9 i7 {6 J3 C: g+ g
较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责
在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化
状态给新合成的DNA链上加上甲基。

            DNA胞嘧啶甲基化检测方法5 l( ~+ V7 q, E) ]

使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：5 z2 A* p- e' T- l
甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)2 F8 p5 I. w$ ~. q
胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：
重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing)
GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT
      测序                         测序: r7 S3 F, p6 P; B
此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 , b# _! d3 y3 o: \* V4 `3 F, z5 U
: p; |6 D3 Z/ d9 t: ~
MSAP
用途：' z8 y. _" `8 K) p8 }$ s  Y, B- D
最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段# L  t. g" j# q' \2 z- ?
原理：
利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。1 T/ Z+ b6 z, \* E8 V: Q
甲基化状态分析：: l6 D/ @. o" z' D3 ?& q
在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。9 B% P0 l6 h* `& Z

表1  甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果

MSAP流程：
) n0 Z$ |+ v1 M* W7 \$ s6 H2 I
. h" N! F9 S" X$ s
                                                   提取基因组DNA
                                                         （注意发育时期和成长状态相同）
                        ………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……
                        ………TAGGCCACCGAACGG CCTG……- N2 X% s" F2 J/ \% Q
                  Msp I 酶切+接头                                  Hap II酶切+接头+ B0 Q) {/ M  Z6 P/ c* y4 |  @
ATCC  GGTGGCTTGCCm  GGAC                ATCC  GGTGGCTTGCCmGGAC
TAGG  CCACCGAACGG CCTG                TAGG  CCACCGAACGG  CCTG# j; Y1 Q  E5 m2 h6 X/ D

                        PCR                                  PCR
# ~3 V8 J( t! W6 v# Q
                        PAGE电泳                            PAGE电泳" x. Y5 ~% q0 F

重亚硫酸盐测序
' t" p, |/ H/ b3 v* v5 z  w
实验目的* O& f2 T$ |) Y* c
使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。  z8 A$ r3 l# C, k5 p

实验材料7 W0 f; |) O1 C# C
水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare)

      5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。
所需仪器5 m; i9 n( j+ O$ s
离心机       PCR仪       气浴摇床       水浴摇床    植物生长箱  L6 L$ ~9 t3 D0 s% `
& w3 Y" P! ]( u, e% y& }' y
2 {5 Z2 I# w  l% j8 r/ Z

6 f  M/ H  }. _" ?* I1 _
3 l2 ~$ w9 Y3 w
  电泳仪       电泳槽       微量移液器       紫外分析仪分析天平 $ r# b0 d+ Y4 D8 D4 N& h

试剂9 N; W+ l: t) b* `: d2 w+ s
植物基因组DNA改良CTAB提取液：( m4 m& W0 [& y! A
buffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA;
buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB;
buffer C: 5%N-lauroylsarcosine
PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O，  V0 i) a: ~2 M! ^) ^9 ?
PCR引物$ ^& {  V- V: ]0 ~
预扩增引物：3 i3 ]) |; Z) @1 o
                     H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)
                     EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)+ Y6 a6 T  J6 x
选择性扩增引物：
                     H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´; k1 G% x$ x# d) v' _
                     EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。" |( Q, U. q2 H
酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer
接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’    4 d& _, u( J0 L0 a0 x8 m
                                                CATCTGACGCATGGTTAA , M  Z+ _: ^5 V( Z; s9 y8 `
                     HapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’
                                       AGTACTCAGGACGAGC
PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， " V8 H0 s1 X0 F$ f; z

银染固定/终止液  (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC ，用时，加入3ml 37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。" Y. f0 l+ l5 j2 y. R
其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λ DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。 6 m7 U! I  Y0 \& N8 |" ?, Z
实验方法& ~1 p7 e/ n% W  R/ {" n7 B) i
5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养
(1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）
(2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天）* v$ v; J+ R7 L% m
  h' A7 u) s+ f+ f
植物基因组DNA的提取与纯化7 t0 {" ]- Q% V- }& x) Q
改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)
      不同处理的叶片1g
                     液氮中研磨成粉
      转入50ml离心管
                     加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)
                     65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟  e+ Y* B/ ]: O% t& U, v3 Y
                     加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟# H/ Q+ n0 R6 W! o6 I. u" a* C8 @
                     4℃3000rpm离心10-15分钟
                  上层水相
                     加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min
                     DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底$ {# r" [) u) s/ `. o- }
                     DNA于70%乙醇中过夜。' W4 |/ H9 `3 F0 K  F8 m
                  DNA沉淀' i6 p  a: R4 P8 b) G& F
                                                               （第十二天）, T" B5 m1 `  T
$ ?& y* X1 N1 U! E. w
                     风干DNA
            Genomic DNA: H* d8 w* O4 G) U% v% ^
                     2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀
                     待DNA完全溶解后，加入5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30                      分钟以除去DNA中的RNA。/ ]2 {: s9 i8 R4 ^, B* \
                     加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟
                     4℃3000rpm离心10-15分钟
               DNA沉淀7 ^- o; `! H9 D6 v/ }0 Z
                     70%乙醇过夜洗涤DNA( G; r1 x  v9 V4 `% R
                     溶于DNA于200-500μl TE中" Z3 T9 |; ^/ U3 K$ v6 i) @- U( e6 G
            Genomic DNA溶液9 D- b6 l- Q8 p3 x+ q
                     0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker                      （未酶切的λDNA）估计其浓度。: O( ]' ]# w$ Y8 x: P
                     调整DNA浓度，置於-20℃备用。
7 }# f: D) B# Y# C7 I+ ~& B
基因组DNA酶切-连接接头
甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。, t7 h% ?3 i% s3 N
水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：
  R: j$ R9 y' K5 v( @# S
PCR扩增
预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：: a, i5 a8 `  w# b: X

- G1 w5 b* ?) n" J: Q! I0 u- Z9 @
& |! E; [; M" ]- F& S- U- D8 P

3 g1 ], P. E1 F3 p

9 N3 l) v; A) R. J. y1 ], f$ J) v

PCR程序：94℃ 预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒, 共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。4 Y2 O  H4 o1 ]: g# j
根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。( \5 t& n  |, E. o' ]4 O% P
9 Y9 ?9 h6 O. t. I+ I$ _2 |
水稻AFLP选择性扩增体系如下： , P$ A- v8 W4 N" ^

/ i; ~- E$ S0 h  j
; I8 r. W, r& M7 A
% V. n# p0 q- S/ q
" w3 {8 G# u' S! W4 }! N
; \$ i1 x  Y) W* b0 s6 R/ O
7 G; ~$ a8 i; b  W
按以下参数进行PCR扩增反应： 5 `4 `$ x* H- j! V, c' g
      94℃ 预变性2分钟, 94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，  55℃复性30秒，  72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。                   （第十七天）
; l6 E: V' A! a: f% ?7 F! b+ o
PAGE电泳4 ]9 K- c4 O( Q( b
电泳装置图

玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。8 b8 J7 U! w; H6 a8 v  w3 _
      自来水清洗

      95％酒精擦两遍
- {) j( Z3 u; F) [
      硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面
" X& y9 h8 `# D0 G% @" o& w7 ]& ]
      5分钟后，95％酒精再擦两遍，

                  装板
4 _$ y/ ]9 o' o# N7 }$ `
                  灌胶 8 M/ @; V: T: a% Q/ P/ u, v
/ P% d4 c& g+ V, W1 n3 W
尿素-PAGE胶配制

: M2 X  Q7 r' J; v2 O6 R- @8 d
3 I; Z+ z' B' n7 I8 ~3 t

      灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。
电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16μL，恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。/ z7 p( k) ?$ O6 k" I+ J/ ~# b

银染操作
电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将4 q& D* T. g& i& V
      附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇
      20分钟，直至指示染料消失。
凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水
      洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板
      从水中取出后，竖起空水15秒。( h9 D4 }- }+ k$ [: n
染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。
凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）
终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。0 {7 ^' S8 K% Q+ |
固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。                         （第十九天）

预期实验结果/ u. g9 Y  F% h( \7 f) {
同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。                                     （第二十天）/ X0 o/ O# K' r" Q

注意事项与建议
五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20℃保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4℃保存，保存时间不宜超过半个月；
丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；9 \5 z: W- p* Q) j5 W% {0 _4 q
思考题
5’-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？* M' x* `# l/ D; I4 G
MSAP的原理是什么？
如何分析MSAP电泳图？
参考文献 6 w" j9 `: |/ g0 i% E# B3 ^
[1] Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40.
[2] Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496.$ [; ]- X8 z, {" b* ]4 D
[3] Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158－163
[4] Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512.

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