有没有做过RNA-IP 的？

markllq

求助：有没有做过RNA-IP 的？我用一个抗体（cell signaling）和IGG（abcam）做的RIP，最后提完RNA（RNA 的总量差不多），做完反转，然后做QPCR，来检测我想要的mRNA的变化。用ACTIN 作内参，发现 actin  的ct值分别是 26（抗体）和23（iGG）, 检测的MRNA 的ct 值差不多都是29 ，这有没有问题？是否说明了我拉下来的mRNA是IGG的8倍？

xyz007

您好！这个内参差别那么大，而你要检测的mRNA却没有变化。不好说啊。想问一下你孵育完了是怎么处理的啊？先用RNA酶抑制剂什么的吗？, O# ?) ]% V& \6 x  x/ x  J  v

markllq

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" b7 b# l% M  f/ a4 b1 A: W5 U; a# E' }1 V
我用的就是nature protocol 上的 方法。RIP-Chip: the isolation and identification of
! m5 f/ v" v) x/ l7 p% BmRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts 。$ V4 v( i7 `2 D' I- m/ X( W) g
孵育完后用NT-2 buffer + PK 酶 消化RNA ，然后用 Trizol reagent 提取RNA。 NT-2 buffer 中没有加入RNA 酶抑制剂。

xiphias

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1 E1 D6 b5 u: ~9 P/ |
! `, R( _4 G% n5 e如果起始细胞量一致，只能说明实验失败啊。actin变化太大了。  

xyz007

回复 markllq 的帖子: W' d, B8 g6 F
, v4 H; l3 s- |) k# f+ ?- }. R
那你做的实验组的抗体和RNA你确定他们有相互作用了吗？是已有文献报道了没有啊？如果没有，我觉得你有必要做对照呀