流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

1 Z( Y- v+ F* {) D2 |+ R0 |
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
  ]# [# \# \1 W% D+ E" N; i先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子! l* s/ O5 T7 A; r' D! ?8 O) F6 N

, b) \+ w% S5 i8 h* a9 F7 l8 c细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子$ \& i8 I' _4 E+ D4 t* Q
' M2 }; x5 \! e3 F
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
2 O, G1 B; Q' x$ X3 [0 i7 B! FA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：, R: s0 q  r4 X+ i
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。4 ?$ H  S3 ?  E% X& \% h+ @! x
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
9 x& t$ T, h. K- u- u4 q# i(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。7 U! |; J# U/ k- C. p7 y' U! j
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。" z7 G  j5 Y' O. C+ T$ o! t
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
" m' b" m7 i7 X9 J最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

* @3 @- M' t; p3 s, g; C6 \$ Whttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
# `+ |* z9 a( G3 tA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
5 L4 j& F  Y9 z0 B2 n4 r5 A(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
4 q5 U5 r  d: L$ e2 _9 a0 ^" l8 b(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
5 l; n. {: J$ o7 g(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。: A; j$ a( Y" @# Y7 e
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
7 W- O, E" O' K: Z

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子3 k( q5 y: }, z
4 \! ^, E# c- l- `* P( l
不知道您的这个流程是从哪里查到的？
; m% _% ]; z1 [& F我们做的大致是这样的：
, j  t: A/ R1 B/ b1：收集的细胞用PBS洗一次；4 y8 u. s, f3 p5 }4 y8 b/ G4 u5 t( x
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
: x+ q% e" b" [# y* K6 G4 c) {( R& N3 L3 PBS洗两次
) n9 m* \* x9 U1 p4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）
4 X; c+ }: B# U如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子
  q+ s8 }2 i% e
7 a3 x* s/ j: H$ g谢谢指教

shaozi402

回复 rocfield 的帖子
  N8 m' F/ _. t+ T9 d# k& }6 q  b$ R/ r& j" L# O/ v, b
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？