流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

; f3 }3 n( \. l! _3 r) _我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
' j% t: J) P' {先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

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  B' U. g8 m  r) T6 {, p细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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7 x( r0 r$ d1 P: N( H6 d) o/ g* ^
( x) C- J, n/ n+ H% b1 Bhttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 3 f, B3 p) N! U/ B$ ^3 Z
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
7 S8 X7 _+ r/ z0 N  l/ H(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
1 L& N5 N8 o0 ^# z" R4 x% {6 Q: B3 c(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
$ K* G: i: C! U9 P4 v(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
# }' X$ B# u; o2 q' ?$ D+ k8 D(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。6 j, u/ M6 k8 d! N4 v% R
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
7 _) a/ F9 H! h) m$ a% \最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

3 o9 d& Z, @: p. g
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
$ M" r' w2 Z! j+ g! kA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
. Q; E1 q7 t. o% B) X(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
3 h8 m, t  V" h(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
! T* n5 k! I2 f' E(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
: O  i+ G; N  X/ i* M' q(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。0 t, @' A$ |( Z0 F; E6 e9 B- E

rocfield

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& X7 Y# e% T! X' N9 d/ Z5 Q  j& p) @; D9 d' F
不知道您的这个流程是从哪里查到的？6 n$ I6 ?1 b9 P& T" A
我们做的大致是这样的：
$ T. j" L. h( j9 l) X9 R1：收集的细胞用PBS洗一次；
+ |: H/ j9 c7 L7 d& a2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；) n% ]: |* U" m2 W+ V! x5 Z
3 PBS洗两次
) b0 k) |+ Q! c% [4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）
+ I- c. t& L9 m. }如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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8 q" X: i4 D6 ~5 ~! v; C! T5 d/ i& T# M" x5 @
谢谢指教

shaozi402

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$ w2 I( ~0 J  p$ L+ @检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？