流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

9 i1 A1 P3 p! c! D8 `3 m( P7 x* b我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。( b7 E3 |; _8 x. o( L* w
先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子
* k$ Z+ l1 A' j, Y" q% X/ z! B/ H, w% @
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子: l; D% q$ Z7 e5 p+ T* V
" y+ l: h5 p& j  V4 B3 B
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
3 l2 _3 m9 p, s# ?- wA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
8 d8 F! H3 l9 a8 S+ q(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。3 a' e( G' ]; A- L& F5 f
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。. y" w% P0 d5 X( r& @& v
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。5 a. ]& C# j4 F& c+ M. E
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。( O- a4 Z1 v% [; k% |0 u
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34 ; W& e# X4 J6 [6 X, z. P2 }. o
最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

' n& V$ S* r$ D7 }
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 # Y) p1 E! v8 Q$ N
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：) z% K( _8 v# u/ j0 J' g) X
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
5 J9 v# Z+ e: a6 ]' n# N, H1 b(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
! h9 ?; X, C& v! q2 r(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。3 G4 h8 e! N! L7 _- u
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
5 a$ U, c/ l5 {7 b' n2 k/ R

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子1 z+ Z  P4 s8 S" A3 x* e
7 q6 Z1 |7 o: }! Y1 e( ?
不知道您的这个流程是从哪里查到的？$ F( ?- ?4 r2 d) C/ K5 `
我们做的大致是这样的：
! B/ v+ @& k9 ]1：收集的细胞用PBS洗一次；# S! Q0 R# R; o8 n
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；0 H7 ]8 |) D9 I
3 PBS洗两次' E3 c9 u7 j  }0 Z+ N; e9 I: m7 _
4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）
- H# _, x9 m- g; |如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子  E: G# z# [5 D5 Y2 W$ M0 X: [# B% [

% |, l1 F2 w0 Z: x) u7 u) e谢谢指教

shaozi402

回复 rocfield 的帖子
, M" q+ H" E* R4 c4 a
2 D0 t! o# U# C6 @检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？