- 积分
- 634
- 威望
- 634
- 包包
- 1809
|
2. 实验步骤7 u& K& {: O+ d
2.1 分子克隆
( Q5 \2 q6 ?8 n从果蝇S2*细胞的完整mRNAs中,利用RT-PCR扩增出编码dTAB2的全长度cDNA。然后将TAB2基因插入到N-端具有FLAG标记的pCDNA3.0质粒中。编码dTAK1的全长度cDNA有Jin Mo Park(加利福尼亚大学圣迭戈分校)提供。将dTAK1的cDNA插入到N-端具有HA标记的pCDNA3.0质粒中。. v8 W( K2 ^- C! f b' b, I
2.2 果蝇细胞的培养与转染
3 Q8 T8 v6 D- n( r( ` 在25℃,S2*细胞在含有10%FBS(GIBCO)的1×Schneider果蝇细胞培养基中培养,并且加入50单位/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素[30]。在加入PGN进行刺激之前,S2*细胞至少与1μM 20-羟基-蜕皮素(Sigma)孵育24小时来诱导分化[31,32]。37℃,空气CO2含量为10%的情况下,HEK-293T细胞在含有10%FBS(GIBCO),1mM L-谷氨酰胺和100单位/ml的盘尼西林/蜕皮素的MEM培养基(Sigma)中。HEK 293细胞使用磷酸钙方法进行转染。
: w8 m9 W. w4 l k( |5 I$ s7 p2.3 PT-PCR和dsRNA合成% b" w, \5 }1 }8 d6 B' C
使用试剂盒(Invitrogen)将S2*细胞的全RNA分离。使用SuperscriptTM RT-PCR单链合成系统(Invitrogen)合成单链cDNA。用于合成dTAB2 dsRNAs的引物序列如下所示,包含一个5’ T4 RNA聚合酶连接位点(TAATACGACTCACTATAGGGAGA),接下来是5’GTTGGTAGCCCACATCCTG3’;另一个是5’GCCCGCACTGAAGACACT3’。这些引物是用来进行敲除效果检测的。PCR程序设定如下:94℃灭活3min,扩增30个循环(95℃45s,55℃45s,72℃1min),最后72℃延伸10min。纯化的PCR产物作为模板使用MEGASCRIPT T7转录试剂盒(Ambion)产生dsRNA。然后dsRNA产物用LiCl沉淀并悬置在DEPC-H2O中。dsRNA在30分钟内慢慢地从65℃冷却到室温。RNA浓缩物在A260下检测并用1%琼脂糖凝胶电泳分析,最后在-70℃保存。
9 F9 `8 \- c$ X6 _9 i8 v2.4 RNAi
7 S1 A+ v; b6 E N 像先前的文献[32,33]记载一样进行RNAi。简要介绍:在6孔平板中,1×106 S2*细胞使用不含FBS的1×Schneider果蝇培养基(GIBCO)进行培养。室温下,加入dsRNA,1h后加入含有15%FBS的1×Schneider果蝇培养基(GIBCO)。接着孵育72h使靶mRNA去除。, r; x% C0 y4 V4 @% \6 H
2.5 Western blotting和免疫共沉淀: l+ [2 V- E- T& p8 B" d8 Q
S2*细胞与dsRNAs孵育3天后暴露在不同的压力状态下,然后用SDS-PAGE上样缓冲液将其裂解。等量的蛋白进行SDS-PAGE(10%的凝胶)分析,然后转移到硝化纤维膜上。识别磷酸化p38(Biosource),磷酸化JNK(Cell Signaling Technology)和γ-微管蛋白(Sigma)的抗体进行Western blotting。HEK-293T细胞的裂解物使用放射性免疫共沉淀分析缓冲液(150 nM NaCl,20 mM Tris-Cl pH 7.5,1 mM 甘油磷酸酯,0.1% Triton X-100,1 mM Na3VO4,1μg/ml 蛋白酶抑制物)处理,然后分别与连有M2 anti-FLAG抗体的琼脂糖珠和anti-HA琼脂糖珠进行免疫共沉淀,洗脱物进行SDS-PAGE分离,然后转移到硝化纤维膜上,分别用anti-HA和anti-FLAG的抗体(Sigma)进行免疫印迹。" r: }1 G/ a% `, R2 j! ^
2.6 实时定量RT-PCR8 r/ t* a& @% b, V* i e
完整的RNA使用试剂盒(GIBCO)从S2*细胞中分离出来之后用不含RNase的水溶解,然后再用DNase(Promega)处理,完整的RNA使用ReverTraAce反转录酶(Toyobo)和dligo(dT)15引物(Promega)进行发转录反应。单链cDNA作为模板进行实时定量RT-PCT。攻击素A和Diptericin的表达量用SYBR Green Master Mix(Toyobo)检测。热循环状态如下,50℃起始处理2min,95℃10min,接下来是两步法PCR:95℃15s和60℃60s,如此进行40个循环。数据收集和数量计算在ABI PRISM 7900序列检测系统(Applied Biosystems)上处理。PCR特性用PCR产物分子重量进行分析并且没一个点都进行融化曲线分析。每一个样品的攻击素A和Diptericin拷贝数量用rp49标准化。引物序列如下:
9 g- [, f& B+ H2 z/ f. JDiptericin5’-GTTCACCATTGCCGTCGCCTTAC-3’,5’-CCCAAGTGCTGTCCATATCCTCC-3’,
8 t: n7 l! i" F3 g, E1 }' o% K& O4 c; Q攻击素,5’-GTGGTGGGTCAGGTTTTCGC-3’,5’-TGTCCGTTGATGTGGGAGTA-3’,) a' P3 `: S; L
Rp49,5’-AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG-3’,5’-CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG-3’。
% x0 u( N' T! h v2.7 荧光酶分析
$ f9 m! m- m# g. Z& Q l/ U/ O4 i HEK 293细胞用两个质粒进行转染,其中一个是NF-κB报告质粒pRL-TK(Clontech)。转染48小时后,细胞在室温下溶解15min(被动溶解缓冲液,Promega)。溶解物使用Dual-荧光酶报告基因分析系统(Promega)分析,用光度计(Lumat LB 9507,Germany)进行测量。结果显示三次测量的平均值。6 W7 \1 h1 h6 R5 w
|
|