最近实验室提质粒时遇见的怪事，请教大家一下

张也行

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8 o) J9 t* f1 a! [) S9 C7 ~我最近提质粒的时候遇见了这样一个现象，前段时间小提质粒，用的天根的小提试剂盒，浓度一般吧（100-200 ng/ul），但是跑电泳的时候发现什么也没有！刚开始觉得是自己操作的有问题，就没在意，又重新做，没出现问题，以为问题解决了。但是前天大提3个质粒，用的是天根的大提试剂盒，第一个浓度一般（1000ng/ul多点，A260/280=1.98, A260/230=2.43），但是昨天酶切跑电泳发现什么也没有，原质粒也点了2ul，居然也什么也没有，第二个质粒，（浓度也是1000ng/ul多了一点，A260/280=1.96, A260/230=2.31），同样点了2ul原质粒，跑电泳却很淡，最后一个质粒比较正常，点了2ul原质粒，很亮！刚才我又给这三个质粒测了一下浓度，第一个质粒现在只有858 ng/ul, A260/280=2,03, A260/230=2.52; 而第二个质粒浓度还是1000
, J' e0 c% j, ]! n多，A260/280=2.04, A260/230=2.42。第三个质粒浓度也下降了一些，但是A260/280, A260/230的值基本上没有变。仪器两次的误差应该没有这么大，不知道到底是怎么回事。
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其实重现做一遍也没有什么，但是实验室里其他人也遇见过类似的现象，所以最好还是找到原因。请问大家遇见过类似的情况吗？怎么解决的。

l123w456x789

你的意思是测浓度和电泳跑出来的结果不一致么？那么胶有问题吗？A260/280 A260/230测浓度的方法准确么？

张也行

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这些应该是没有问题，因为其他的质粒都没有问题的。

chochochocho

电泳后没有质粒条带，有杂带么？质粒用什么溶解的？保存条件呢？用kit提的都应该1.85左右吧，怎么会2.多？不过没用过你说的那种。

开心果王

前几天我用omiga的大题试剂盒抽了oskm四因子，完了测OD发现都在2.0左右，浓度在1ug/ul左右，用去内毒素水2ml溶的。算下来有2mg左右，可是试剂盒上表明200ml菌液最多也就提取1mg左右DNA，让我感觉很是怀疑DNA的纯度！跑电泳发现有RNA污染。不知道会不会有基因组污染呢？还想请教楼主RNA是不是会影响转染的效率？

张也行

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有杂带也好啊，关键是第一个质粒电泳连一条带都没有。我看的说明书上说质粒A260/280比应该是1.8-2.0吧

张也行

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RNA不是很容易降解的吗？加一点RNA酶应该可以去除吧，再说你们要是上细胞的话不乙醇沉淀吗？/ t) `; `! G/ l0 T, d
对了，你怎么看的出来有RNA污染啊？0 u" P, g" Z' \) ^6 n+ U

chochochocho

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, B8 b6 s: l3 R1 a" k/ ]所以问你用什么溶解的怎么保存，一天之后就从1.8变到2.0。 什么都没有也可能是你的培养有问题，杂菌不带质粒的。你可以省略电泳，直接用EtBr和样品做浓度梯度再比较marker，检测你的仪器设定是不是OK。RNA很难提出来吧，kit的buf1里都加了RNase，但做得不好DNA杂带有可能有的。

张也行

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/ G, g; c' U) T3 g我就用的天根大提试剂盒的Elution Buffer溶解，保存的呢。! F& N9 E3 X) K, w! J& C
仪器应该没有问题，因为别人的，还有我的其他质粒也没有问题。. ~8 O/ Z2 u8 |5 z
你说的“直接用EtBr和样品做浓度梯度再比较marker”是什么意思呢？不好意思，没有太理解。" l- |& X% D9 U  i& l
我今天又用大提之前，从锥形瓶中里取的菌液又重新用5ml LB摇了一晚，今天小提的质粒照样没有条带。这说明我之前保存的菌有问题了，质粒丢失了？
6 O* p% r+ N& B" q5 G! \$ Y保存之前提过质粒，鉴定正确之后才保的菌种。用的是700ul菌液，400ul甘油，—20°C保存。会有问题吗？你们是怎么保存菌种的呢？" M" @5 ?0 `2 S( F3 K
如果没有质粒，细菌哪来的抗性呢？

痞子的烟头

这个问题真不好说，得慢慢找原因，我没有用过KIT，所以不好评论KIT的效果，但前提要保证你的操作没有问题，我以前大提包毒用的质粒，都是我们自己配的试剂提的，你的OD值也有都不错，胶也没有问题，浓度也可以，结果什么也跑不出来，考虑你的胶浓度？电泳时间？EB？，另如果你的质粒确实存在，双切下试试，要不就把原始质粒重新转化；至于冻存质粒，一般最好配80%甘油，用20%冻存，——80度，