欢迎培养MEF细胞的同仁们进来分享一下培养经验

huozhicb

过两天我再养，给你算算

mbjane

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* Z0 t4 n0 R% w/ ^& c
非常感谢您的回复。根具最近的实验数据，我也感觉原代铺板适宜密度与您的经验（8个小鼠可以铺到6个10cm dish）相似。5 W2 a6 A2 ^9 s4 g* M" _
说到传代，我只发现细胞形态逐渐变大，立体感越来越差，没有发现变得小小的？这是什么原因呢？

igdb

消化15分钟太长了吧，我一般都消化5分钟，两次。绝大部分组织都能被消化成单细胞的。。

happygrass333

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7 [$ g' p2 V  ?# v" P7 a! M; D: F( Y  f7 H. M
MEF是单层的，本来就没有立体感。比较好的状态是刚铺下去的时候大概2小时你观察它呈圆形，有突起，有的看起来跟太阳一样中间一个核整个细胞铺得非常的开，但是第二天可以发现细胞进一步伸展变细。后面营养要是不好了，会细细的变成丝。你说的情况是不是因为小鼠的种类不同造成的，我们是昆明白。

mbjane

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  ?5 |. {: f  I% |2 C  X0 T! Z) A8 t2 E$ b; g+ ~
我们用的是近交系BALB/C

mbjane

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; Y1 U8 c/ `, ]) u8 C9 H8 E( [+ M3 a
5分钟就可以了吗?胰酶浓度多少啊？0 d4 |0 E: f# S9 A

happygrass333

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$ d* O. p$ N/ @: M0 p% `6 N2 G9 {) n# B
我们只用过一次c57，不好，又回归了昆明。

igdb

回复 mbjane 的帖子7 Z$ d7 i8 U1 d. Q5 Z8 T

7 w3 d; w6 a5 n0.25%

jhu132llh

1.PH是7.2；
6 d' }, z! ~( S9 ^0 `2.接种密度为一、二只/皿；胚胎要去头，去四肢，去内脏；
, q: F* o; f9 j& ?4 Z/ a3.MEF在三代内使用，不要传出三代，细胞状态不好；
$ Z* a  {' _1 t7 r: j: d; K4.MEF状态的简单评价：增殖效率和细胞形态：要求细胞增殖快的状态好，要求为典型的成纤维细胞特征的好，要求细胞结构清楚无大脂滴泡无大黑点为好；
7 I  ?+ H- W4 c5.原代一般长至80-85%时传代，一般是原代2-3天就能传代，传代培养一般是2天左右传代；
) K, |5 X/ c8 ?4 o5 y& x1 u6.孕鼠主要通过检栓来了解准确怀孕时间，检栓是为第0.5天；, l  ~# w" @* D

bubble_w

回复 mbjane 的帖子9 K- a0 ]: i/ |  ]. F
8 e8 p5 Y- Q& l1 r7 H& V9 a5 e
1.原代培养一般2天即可传代，最多也不过三天。如果超过三天还没有达到传代的标志建议楼主再做新的原代。1 p! s- q' o+ H
2.孕鼠的状态我们一般不做太多的评估，主要是饲养条件要清洁级，而且尽量选择每年的四月至六月以及九月至十一月去配老鼠，这时段效果比较好。还有一定要去除寄生虫，每个月对鼠房进行熏蒸，老鼠喝的水最好高压一下。如果能做到以上这些一般都木有什么问题了。小鼠的品系最好选择B6D2F1，ICR也可，昆明小鼠最好就别用了。
5 V( a% T3 v* e5 d, y# u8 Q3.尽量去除MEF以外的细胞，主要是操作过程中多剪掉一些，不要舍不得。胰酶消化的时间要短一些，尽量使用剪刀将组织剪碎一些。
5 w6 x- m' ]& q8 F3 k# o4 B# F; J4.不知是我上次回复的不清楚还是如何，我的意思是尽量留一些小块的组织块，会爬出很多细胞，而且细胞生命力很强，状态较好。有时我在传代至第二代时仍有少量的组织小块，非常小，细胞状态极好，基本是每天都要传代，传代比例是1：3.- O$ ~$ J. q  M/ _
5.我不知道你的皿的多大的，我一般是大皿（100mm）8-9×106/皿。$ j, i2 K1 Q$ l) f