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1、细胞培养不像胚胎需要一个严格控制的PH值。一般公司买回来的DMEM我们实验室不添加任何NAHCO3就感觉不错。有时为了提高细胞状态会添加一些GLU。
' d' _: U, S; j" O4 Y2、原代培养一般是2-3个胚胎接种在一个100mm的皿内。
, W1 e+ i# D+ H. x3、一般MEF的培养不需要明胶包被的皿,在处理为饲养层后接种干细胞时才需要。
" H+ p5 T) x& H$ Y4、对于MEF状态的评价主要是以增殖速度以及细胞的形态是否为紧凑的不规则多边形为主,同时还会注意细胞是否有支原体污染,这个是原代常出现的问题。
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: _* |3 u$ n! G2 g, p本人做干细胞以来,做了无数次原代,以下是一些摸索的经验:
! Q& B$ F) I# Q+ K2 @( B$ M1、MEF的状态其实主要取决于孕鼠的状态,一定要清洁级饲养,否则取的胚胎质量差,做成的MEF差别会很大。& F3 A& ^+ {% S( k+ `4 y1 G, [7 H
2、制作原代过程中,一定要尽量去除除MEF外的其他细胞,纯度越高越好。* o4 p$ t( M9 U# P$ l( v
3、建议原代中少些带有组织块培养,MEF活力高。
7 [, t$ B$ S4 A9 p& R5 e4、一定要注意外源污染,一旦发现立即扔掉培养皿。+ k- P7 j0 K7 a1 [) C0 N k0 Z
5、细胞一旦出现形态肥大,凋亡的形态,建议不要再继续培养,再做新的原代。5 k% j$ `1 i" ` }5 J' ]
6、我们的经验是一旦做了一次优质的原代以后,可以传至第五代再处理为饲养层,细胞状态仍旧非常好。这样可以三个月都不用再做原代,关键是一定要从胚胎时就状态好。 |
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