血细胞计数板计数与流式相差一倍，怎么解决？

WAX

细胞计数过程
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1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。/ K4 }& E$ G5 f. c4 W

$ s* I- I' W0 q/ \) T( {2.制备计数用的细胞悬液：用移液器吸100μL细胞悬液到一离心管中，加入100μL PBS进行稀释。
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* |# F2 _1 {4 N4 c3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取10μL悬液沿盖片边缘缓缓滴入，盖片下充满悬液。% I" Q. k2 E/ h( E- P4 a

4 j; m' ~  _# d! J* ]' S" N4.统计四个大格的细胞数：数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。一般我计数时每个大格里有50个细胞。9 ?3 _. U& E) _  J1 ~3 O

+ D, t+ V* C+ @- H( N  o& I5 x

2011-3-7 10:45 上传

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# K3 R1 W3 {- `1 s; i' L4 @) h6 }+ b! q8 N" ?6 F
5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：# {8 q/ a6 \5 B9 ~# y

5 T0 ^1 h" @: h- m9 s" Y  D（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×1049 M& ], y9 O* Q0 a8 k3 I
* T6 A" Y: ~6 _* X9 o+ [
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液稀释一倍。
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4 T: G& O3 o5 f; y流式计数' ^# @9 o' x2 v) ^: z* m* M2 S6 A

1 g) K6 T! c: W2 b细胞计数板计完数后取一定量的细胞（如500万个），经过几次离心重悬后上流式计数。离心速度为1000rpm/min，离心4min，转子为水平转子。而跑完流式只计到200万到300万个细胞。
) V; X. W% `6 N+ ]1 O% y3 C3 k
! @, g; i4 @  a& Y* j4 @不知中间出现什么错误导致这种结果，还望各位指点！

askage

( t  q& L: g8 ~$ h7 A  A9 Z

  f0 i* K4 y; f离心的时候最好用g来描述，1000rpm未必能全部离下所有细胞。我曾经也是这种经验，1500rpm离心搜集细胞，结果发现上清还悬浮到N多，加大后才离心下来。不同机器，半径不一样，转速描述不适宜。用G来描述最科学，300-400G,离动物细胞比较合适。

WAX

回复 askage 的帖子
* F2 C2 A8 i% p  R8 g: r: a9 v9 N, ]( V
多谢指点，离心机是用rpm表示的，我也不懂的换算。我也想过加大转速，但到1500rpm会不会对细胞有所伤害呢？

深海寂寞鱼

to WAX站友：: _9 i2 Y4 V4 j+ t5 E

/ J  G( u( O8 V1 g; l9 E/ N我认为可能的原因有：( p# c# W5 w7 V! k: c0 E5 p, X
/ l1 C: W. s) C5 x2 X- W# T
    1. 反复的离心重悬，丢失了一些细胞。通常推荐300g 5min 。  对于为固定过的细胞这样的转速损失较少。1 r( b% {: N$ v  k8 m; a
        但是，对于固定过的细胞或者打孔处理过的细胞依旧会有一定的损失。& ?* Q7 ]& j: _, |  y
4 b+ s( w3 j( f) \, r9 ]% I
    2. 不知道你用的什么样的流式机器。一般机器也会带来损失。比如通常用到的 BD FACScalibur, 在你上样的时候，如果你没有及时将开关转换到正位，
2 X# I% l0 P4 M9 Y        那么外管很快会吸走一些细胞，而且速度比内管要快。/ I% s6 r* Y# _  s, t$ F

+ N6 \4 [, k7 O    3.  流式管中的细胞不可能完全上样，总是会有一些残留，包括泡沫里面也会损失细胞。6 \8 s2 K, v, Q$ L7 _7 Y% L5 W

' _0 K. g1 _, s2 z另外，我还有一点疑惑。你说你取了500万个细胞，那我想知道你是用多少ml液体重悬？1 Y- t, @7 \' ]- N* ?
          通常流式样品浓度推荐：1*10E6/ml   ，而流式管本身也就是5ml体积。" C5 @0 q. j0 r. l

2 X; W2 h. @  ]6 a5 D6 B$ G1 c          不知道wax站友是做的什么检测，为什么需要那么多的细胞？
9 `. u0 O* `5 {+ m4 r4 l9 w. M  d( ~, P6 y
           欢迎继续交流。

WAX

回复 深海寂寞鱼 的帖子& _9 P# K% H3 o' J6 v

) P  z. v' k2 W. ~0 z/ y非常感谢老师8 x% N0 G3 h! d2 V* q9 M
1. 离心机是用rpm表示的，不知怎么换算成g,不过一般1000rpm应该可以了吧，有人建议我用1500rpm，但我担心会对细胞有所伤害，细胞没固定，分选后还要继续培养。师兄一般用800rpm,5min，却没有我这样的差距。
4 c+ B0 b: Y' f6 _/ `2 T2.用的是BD FACSAria II。/ u* x6 O4 V4 F( h8 I. |) ^
3.残留每次我都会再加一液态继续上样，不怎么见效。
( b2 s& @6 f& x4 k3 Y* S我在做SP分析，所以细胞用量较大。500万个细胞我一般重悬到0.5-1ml,也就是5*10E6/ml   左右吧，曾经也重悬至1*10E6/ml ，但上样后低流速情况下每秒钟只有几百个细胞，老板说这样速度太低，至少要上五千。因为要分选，为保证好的CV，没怎么增加流速。只好浓缩细胞。

深海寂寞鱼

- W9 E: @7 m, b/ P% M8 g+ s& R7 T6 l, z# j
to WAX：. l: T6 z( D1 C# j" g

& s7 \1 w# t! m     看来你的实验条件很是不错啊。羡慕一个先。* E% g, N0 B0 r! t% k" t' b1 k

3 W5 t' y' [. [+ B; x* Z* _2 C$ ~     你们的BD FACSAria II 专门配了一个近紫外的激发光？
1 e" z* v8 l( I& c/ ]2 q* f2 O( ?6 R- e) Q3 y
     1. 关于rpm和g的换算。你可以查阅分子克隆第三版的附录。那里面有。
- ~" R: t  j: [) U6 G
3 O% _- e1 X: `7 X         就是在知道转子半径的情况下，用尺子在那个图上连线就可以知道了。
& C' K. i; G( Q+ ^1 Y, `, J& m, F- u/ {1 x# u' i9 F0 p
          1500rpm不会对细胞有实质性的损伤。反倒是你吹打的过程。: ]& I7 I; g: M- K. d5 q. S. a

7 V- v' z# }+ H) a, x  l" G: u. g      2. 你的细胞浓度可能有点高。每秒种几百个细胞，已经很快了。越快的上样速度会带来较低的分选阳性率。) n4 q. C; q7 @, Q! b
9 y" I% E4 f* i6 v5 c: t# n) D
          你所谓的“低流速”其实是个模糊，并且相对，的概念。FACSAria II应该也是有11阶的上样流速。
4 D$ J/ F9 Y. k& j/ o4 e, b9 h          越高的数字表明越高的液体流速。但是你只要看你的每秒钟的Events就可以。; Y2 J0 I3 U9 y

7 X4 }9 D/ a: m/ i3 h3 q( Y          其实在1*10E6/ml的浓度时，3速就可以有每秒400左右的Events。不然的话，就是你样品制备时损失了细胞。5 q1 k7 ?" h! k5 I/ J0 M$ h7 U5 U
1 |& x8 n( g. e, |4 _- p2 c& G
          至于你老板的建议，我持保留态度。我觉得你的上样速度可以保证良好的分选阳性率（纯度）。. N# u7 Q* t6 P* n
. C- e; g7 [9 ?
          当然或许你老板拥有丰富流式经验。9 e, U; E1 P1 [" ?, ]
4 N7 K- O% O0 w  Z' q( P0 l' \
          欢迎继续交流。共同学习，共同进步。

WAX

回复 深海寂寞鱼 的帖子9 ~# x" ~' C5 h
6 j2 P4 u, b0 Q& l! F
呵呵，谢谢老师，收益匪浅。的确，以前1*10E6/ml的浓度时分选率很高，而现在增加浓度后分选率降了好多！再和老板商量下！多谢。

张也行

2 t$ e; |5 w  N( U+ Q) ~1 x' H& J0 P. k: L
不知道你用计数板的时候是否用溴酚蓝染色，应该会后死细胞吧，不知道流式能够区分活的和死的细胞啊。8 F" v/ g2 o( F  c( A
离心重悬的过程也会损失一些。
# L; Y8 \/ u' ^我细胞计数一般是把10ul细胞悬液直接滴到计数板上，然后盖上盖子，小心气泡。而不是从一旁加，然后毛细作用铺满，个人感觉没有直接加的准啊。# v; H! {, ^* L  S4 V1 ?

. l) S1 P4 j# B不过你用流式不只为了计数吧，好奢侈啊... ...

WAX

回复 张也行 的帖子5 U8 z$ g8 t% z. N8 I7 G5 o7 ]* _

' s6 Y; }% G+ q呵呵，流式当然不是为了计数。只是前后数据相差这么多，实验的可信度必然降低，细胞加上染料就可以区分死活细胞了，不过流式计数计的是全部的细胞数，计数板我也没用染料。

张也行

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' u7 ~1 B" P( b) R- ^0 U) x6 `5 f: ~4 P: X( \5 {; X0 l$ G  m0 ]1 Z
哦 哈哈。我想还是相信流式吧，计数板也不是很准的啊... ...