血细胞计数板计数与流式相差一倍，怎么解决？

WAX

细胞计数过程
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1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
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2.制备计数用的细胞悬液：用移液器吸100μL细胞悬液到一离心管中，加入100μL PBS进行稀释。
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3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取10μL悬液沿盖片边缘缓缓滴入，盖片下充满悬液。/ F, _4 t# P6 g5 r6 f' g# J
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4.统计四个大格的细胞数：数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。一般我计数时每个大格里有50个细胞。
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2011-3-7 10:45 上传

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5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：
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（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
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9 D% l/ t$ d2 W8 v- ~# H! s说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液稀释一倍。* u+ j2 @8 v* q( y- m7 x

9 ~5 \5 [4 {7 H/ j. P流式计数
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细胞计数板计完数后取一定量的细胞（如500万个），经过几次离心重悬后上流式计数。离心速度为1000rpm/min，离心4min，转子为水平转子。而跑完流式只计到200万到300万个细胞。+ f3 R7 `; I/ G, U* s5 m

6 \  p9 H: [5 x$ X2 K5 }; ~不知中间出现什么错误导致这种结果，还望各位指点！

askage

7 D, f: Y7 k/ f0 n3 F1 C6 k* o8 @; B. {0 I
离心的时候最好用g来描述，1000rpm未必能全部离下所有细胞。我曾经也是这种经验，1500rpm离心搜集细胞，结果发现上清还悬浮到N多，加大后才离心下来。不同机器，半径不一样，转速描述不适宜。用G来描述最科学，300-400G,离动物细胞比较合适。

WAX

回复 askage 的帖子
  A4 C( ~1 c/ H3 p. Q( d3 f4 a) b5 M4 t6 y) a
多谢指点，离心机是用rpm表示的，我也不懂的换算。我也想过加大转速，但到1500rpm会不会对细胞有所伤害呢？

深海寂寞鱼

to WAX站友：
4 g/ O5 |; A* Z% s" B/ [0 P) r. H7 S3 \. H- t" n8 T8 g* {; l
我认为可能的原因有：
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& W  ?& D! b% v( Y, w    1. 反复的离心重悬，丢失了一些细胞。通常推荐300g 5min 。  对于为固定过的细胞这样的转速损失较少。8 A8 ]. Q/ {4 j2 }- s
        但是，对于固定过的细胞或者打孔处理过的细胞依旧会有一定的损失。8 R$ C* Y% _0 m

7 j" H/ d- n2 ^8 C6 D( e1 T- V$ y) j+ L    2. 不知道你用的什么样的流式机器。一般机器也会带来损失。比如通常用到的 BD FACScalibur, 在你上样的时候，如果你没有及时将开关转换到正位，- n. m! S+ u0 T: g
        那么外管很快会吸走一些细胞，而且速度比内管要快。- b( F0 r  i5 y( [1 D$ i$ \6 j+ r
7 B9 p* Y+ }: j. D
    3.  流式管中的细胞不可能完全上样，总是会有一些残留，包括泡沫里面也会损失细胞。
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! r: ?* _; P1 v# d- p5 y; W% p另外，我还有一点疑惑。你说你取了500万个细胞，那我想知道你是用多少ml液体重悬？
& @6 ^/ x2 n# V/ c  C          通常流式样品浓度推荐：1*10E6/ml   ，而流式管本身也就是5ml体积。
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          不知道wax站友是做的什么检测，为什么需要那么多的细胞？' g! M! s  z/ j6 M  d
: g9 j. X: K, P3 c
           欢迎继续交流。

WAX

回复 深海寂寞鱼 的帖子8 s$ |  u% ~9 `# L9 E& ~

9 R7 K% K/ ~& A! G/ ^0 d# _6 ~非常感谢老师4 j+ N7 I2 U& J/ C# ]; d$ F% C
1. 离心机是用rpm表示的，不知怎么换算成g,不过一般1000rpm应该可以了吧，有人建议我用1500rpm，但我担心会对细胞有所伤害，细胞没固定，分选后还要继续培养。师兄一般用800rpm,5min，却没有我这样的差距。
- _( r  P) W: ?8 i6 C( r2.用的是BD FACSAria II。# i6 b  V; B, f* C
3.残留每次我都会再加一液态继续上样，不怎么见效。2 E& v. V3 T& _& e9 C! a6 e. `; H
我在做SP分析，所以细胞用量较大。500万个细胞我一般重悬到0.5-1ml,也就是5*10E6/ml   左右吧，曾经也重悬至1*10E6/ml ，但上样后低流速情况下每秒钟只有几百个细胞，老板说这样速度太低，至少要上五千。因为要分选，为保证好的CV，没怎么增加流速。只好浓缩细胞。

深海寂寞鱼

" K2 _( i, u. [0 e2 N( V8 ?! S
4 ]2 |# M0 p, K* N; d2 `2 |# u
to WAX：; P  x. m0 s. ?7 E4 S6 V2 U" u
  I. Y& S) b+ K3 c8 n8 i+ B
     看来你的实验条件很是不错啊。羡慕一个先。
% d! f) t$ s/ x7 A9 s+ _3 l% f2 U5 x' V  v! M8 y
     你们的BD FACSAria II 专门配了一个近紫外的激发光？2 u) F9 S* N1 }
1 \2 p; Z' r' M% w! L, o
     1. 关于rpm和g的换算。你可以查阅分子克隆第三版的附录。那里面有。& Y, j" f: Q# q4 q

* u  V0 u) R7 C* d         就是在知道转子半径的情况下，用尺子在那个图上连线就可以知道了。! }- y% _0 R( k
/ e/ w0 g' ^" ?2 C$ Y' F/ M( e0 }
          1500rpm不会对细胞有实质性的损伤。反倒是你吹打的过程。
& j2 y- B) @1 G/ j: j3 e  c* e" D- R' I- W) t) i
      2. 你的细胞浓度可能有点高。每秒种几百个细胞，已经很快了。越快的上样速度会带来较低的分选阳性率。
5 [& G3 Z$ z' |2 M9 G$ t4 M+ q* y' `6 v8 y. @! `9 v) n
          你所谓的“低流速”其实是个模糊，并且相对，的概念。FACSAria II应该也是有11阶的上样流速。
6 X  }1 ?1 |' a( B( F& Z3 y          越高的数字表明越高的液体流速。但是你只要看你的每秒钟的Events就可以。8 W3 v# A2 P6 ?# `3 Y. e

, B5 e" P0 H& G% J; J" p/ @          其实在1*10E6/ml的浓度时，3速就可以有每秒400左右的Events。不然的话，就是你样品制备时损失了细胞。
  @6 I( g  L* W; i& i
" s. c& g8 n! X/ Y4 P4 O          至于你老板的建议，我持保留态度。我觉得你的上样速度可以保证良好的分选阳性率（纯度）。
, J0 Q9 C% W9 H7 n0 ^+ m$ [- j, Q7 y( h: f+ s% J& ]. D! L3 s2 l
          当然或许你老板拥有丰富流式经验。
* y+ t5 x' ~0 e+ Z* ^" g
$ {6 z; b( Q; F          欢迎继续交流。共同学习，共同进步。

WAX

回复 深海寂寞鱼 的帖子, [; Z" a0 b! T( s
- [5 x) F& b+ `5 @
呵呵，谢谢老师，收益匪浅。的确，以前1*10E6/ml的浓度时分选率很高，而现在增加浓度后分选率降了好多！再和老板商量下！多谢。

张也行

$ @7 R0 a6 r1 A$ d) `" c& u& V8 u. T  m: q: x
不知道你用计数板的时候是否用溴酚蓝染色，应该会后死细胞吧，不知道流式能够区分活的和死的细胞啊。, j' k* c9 }9 }# {
离心重悬的过程也会损失一些。
( ~3 g, ^' d- W我细胞计数一般是把10ul细胞悬液直接滴到计数板上，然后盖上盖子，小心气泡。而不是从一旁加，然后毛细作用铺满，个人感觉没有直接加的准啊。
, W4 i- O, W/ U% q; e/ w; O, a
+ A& T( p: Y+ Y$ _不过你用流式不只为了计数吧，好奢侈啊... ...

WAX

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% {! ], x  i; r& S: ^5 U8 @- v- S9 Y. I% ]( N
呵呵，流式当然不是为了计数。只是前后数据相差这么多，实验的可信度必然降低，细胞加上染料就可以区分死活细胞了，不过流式计数计的是全部的细胞数，计数板我也没用染料。

张也行

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+ g# X% T' |1 n& V4 v' D哦 哈哈。我想还是相信流式吧，计数板也不是很准的啊... ...