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回复 hualin840518 的帖子. G5 I, O7 X6 z+ _) d
4 J7 \* ~7 t% w1 H
荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交, Y! e2 O5 P0 F4 q+ S5 r5 d! F
* ~( H8 U6 k( A' j' @/ f- n3 B! [实验流程
" w- q, k6 I; r Z
$ G) O: N- o. d. A" c第一天
5 d- a5 C; ~( _. n& y0 l缺口平移标记探针
- m. J9 e( D3 Q1 q0 x! A1.1 试剂准备/ x' v% l+ X1 K" D, O
(1) 0.1mmol/L dNTP" W# @9 |1 _; r! H
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。% F" n, [; ^7 |1 C" T
(2) 0.1mmol/L dTTP- T- \( N( o: P
1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。
/ `3 [; c7 ~0 v( H$ R' H1.2 缺口平移体系和反应条件8 f2 q- x4 v9 u1 z$ R: K# }! x
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
% ^1 z# y& c3 E0.1mmol/L dNTP 10μl
! m* ~$ s. S! a$ }4 y10× Nick Translation buffer 5μl5 e# g/ H. O. f8 l8 ^3 R# \
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl! n' o# x. S9 n2 S% R/ {7 N8 @
Nick Translation Enzyme 10μl
$ @' i& v+ b% E+ _3 v8 l' H$ m! ZDNA (1μg) X μl4 H( n8 C5 e- m
H2O 18-X μl
U" d# D2 a5 N7 r4 fin total 50μl
! P2 G$ C) ]0 `* J3 c以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃ 反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃ 反应9小时。4 ^& d1 S& s+ l# C2 ~- r
1.3 凝胶电泳判断探针大小
- M d2 _7 \) e) S6 y将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。
P% q3 o! i& v6 h6 K1.4 终止反应- y4 X1 N* ~& L+ e8 r4 b. c5 a
向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。8 j. i6 r% {/ @2 A2 `+ B& e- T
" f$ E1 A1 c6 ^8 ?% c第二天
! _# h% _9 D6 T5 d( T1. 探针的沉淀和变性
% S* f% U2 Q! S/ T' b# _1.1 探针混合物的组成
8 W; U! `) _2 z* W(1) 对BAC/PAC探针( f% c4 Y" t, m2 H Y
DNA探针 5ul5 ]/ K8 v- d7 b1 S4 y
Human Cot-1 DNA 3ul4 o, P. h. U1 G
Salmon Sperm DNA 0.5ul7 K# y" f; g) M% }! n4 x9 j* Q
H2O 1.5ul. x3 z0 }/ b5 {" d& A- _9 K5 j
in total 10ul
% z1 L1 [% @- z! g" j$ I1 i(2) 对着丝粒探针:9 F1 F5 e- }& Z' Q% X
DNA探针 5ul
% q! \% R/ s# XSalmon Sperm DNA 0.5ul, R) D( Y' I) w6 ^) N/ S+ J; E% T+ l
H2O 4.5ul1 A# N1 E t: u( X3 v2 {* `+ z. |
in total 10ul
k" Q1 ?$ G# F' r+ R1.2 DNA的沉淀
5 a7 F/ l2 N6 I; D将探针混合物与1ul(V/10)3M 醋酸钠(PH5.2)和27.5ul(2.5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。3 Q X$ m1 Q3 z1 g# y
1.3 清洗沉淀% I- e7 C' O3 |& @
小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。
0 x' a3 X' T7 r5 [6 V注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底清除乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。
4 e5 u% e" l$ ^2 R, F7 i' |) b8 ^1.4 溶解探针
6 K; E/ O. m& N% ^加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。2 {( @: E8 \& @ r5 p) H
注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。2 B& V; K# g) \. n& N; A
1.5 探针的变性和预杂交3 z+ z% R7 G, `
短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。1 a1 n4 P3 Q2 ]* B
2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性
# Q. \; `9 h( f! \; e2.1 滴片和老化
1 ]8 ?3 ]- a! S4 E$ W$ {取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。
5 I/ g+ b5 e4 U$ r( g& N, A% S; [% Z2.2 RNase A消化
! j- g' w; Z$ \- Q( M! R每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。0 ?5 T0 M' b: M! L: F
2.3 靶DNA的变性
& `8 Y& g" n) _. V将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。$ l B5 m" _) L& G, L
2.4 蛋白酶消化* |* R5 R, {# P, Y- k% V9 W, B
将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。% n* H. x) e8 a7 q
注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。
9 I V! z' q8 I3. 杂交
- t( c" K5 K+ A$ c, y/ v将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。
0 G2 U+ v: I- S
4 A. u) Y# Q% Z* z4 T第三天1 G) T( z# T- G) y: ^% B3 `
1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大 X$ l: \8 a3 B6 I$ p) d2 }* Y9 A
1.1 杂交后洗片
. G. _0 I/ W' W+ U6 R9 j% B小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
( g, e& }& E$ w% I3 R; N0 ~5 Y注:此后步骤应注意避光操作。
. o9 Q! c- H4 G1.2 滴加一抗
& U. ?. A* g) k' R9 d, x$ x8 u# Z将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
$ l+ u }) T: X: g8 O0 w- V2 M$ u4 B1.3 滴加二抗
g( t) o2 Z5 O% t4 P* j& y8 N/ e* H将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。
# @- n, n2 _2 f& u, N& F2 d1.4 滴加三抗) ^0 ^/ \( O6 e
将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。5 t& a% e9 o2 e' q
注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。- x5 W1 m9 A' V( E
2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片
7 E9 o/ d* F! V$ N将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。
- p8 i6 r+ ]4 ]' d. _: _" R3. 荧光显微镜检测FISH杂交信号1 h0 |+ o0 J; r( [% k$ n
以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。# P, ^0 D7 U' \" {
4. 储存数据4 R5 f& v) m: n) @7 u/ Z
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