成骨诱导——茜素红染色鉴定

kgx1986

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本人做兔子骨髓间充质干细胞成骨诱导，21天后茜素红染色，图片如下：

kgx1986

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+ `6 B0 u( p7 Z7 R上面的图是高倍镜下观察所见，中间的图片我觉得是茜素红没有漂洗干净，最下面的图是低倍镜下观察，钙结节（？）扑面而来的感觉。
" \. ?1 J0 C8 e% B. h& E我的诱导方案是：
! u3 }+ q- ~" [( e成骨诱导：DMEM-HG 10FBS& j  d. l3 `4 T$ z0 Y
试剂                                                溶剂                加入量l/ml                终浓度                        储存浓度
2 N  w8 w8 {, u) e, m' R* b7 y-磷酸甘油                                        PBS                10                        10mM                        1M0 j5 F( Q- U/ ?- U9 m
抗坏血酸磷酸盐                                         PBS                1                        50M                        50mM
* Q* d2 ?0 B2 u1 n% t) z) j4 k, ^地塞米松                                              去离子水                0.1                        0.1M                        1mM0 S8 ^3 [- f% f# g

9 e& X' p, T$ v- S* V不知道这样算不算诱导成功，寻求做过的老师给予指点。

呆呆鱼

看图片染色是诱导成功了，不过可能浓度条件没摸好，效率不是太高，钙结节比较少，而且细胞密度也太高了，这样细胞会有生长接触抑制的。建议做一下药物浓度梯度的实验，找出最佳诱导条件，细胞密度在70%左右融合度比较好

ljs

1.楼主，你的阴性对照呢？先把那个发出来再讨论实验结果，设阴性对照和阳性对照的目的，楼主自己想想，阳性对照根据实验需要酌情设立，但阴性对照是必须的。没有阴性对照，属于实验设计漏洞，意思是整个实验及结论都是不予讨论的，没有意义。
' G" x! P- i; D# n2 K/ w/ T4 F2.成骨染色方法好像还有Alician blue（阿利新蓝），国外的文献很多用这个方法，也要有阴性对照，我做的结果是：+ E* o$ U: R6 y, E) Y
（1）只要时间允许，染色试剂的浓度高些，阴性对照也有（假）阳性，真假有待论证。
* _$ g9 n3 T+ s0 p, |; k（2）试剂的浓度低些，染色时间短些，阴性对照就没有染色。
* Q/ S, k. _: g+ e- u- f2 I3.茜素红我没染过，但都是作为化学试剂染色鉴定方法，染色的特异性不会和上面的结果有很大的差异。

billywang007

同意楼上的坛友意见！& ^/ Y: e0 F" c
首先得有阴性对照，其次染色剂浓度和染色时间可能需要再摸索！好像染的有点过了！

kgx1986

回复 ljs 的帖子9 r$ M9 L3 G) {" N3 L9 C
* m3 _$ A# J( c- O% U% y
多谢指点，阴性对照暂时没有上传是因为我害怕之前上传的图片大家觉得没有诱导成功。现在补上，再次感谢你的指导。

kgx1986

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回复 ljs 的帖子
+ j: U7 X7 R1 M6 `% a3 [- E' s$ w0 k$ I7 y' R/ G$ Z/ @) \
（1）只要时间允许，染色试剂的浓度高些，阴性对照也有（假）阳性，真假有待论证。5 b! o6 c, H2 F, _' h% }
（2）试剂的浓度低些，染色时间短些，阴性对照就没有染色。
# C$ k, K; I: a" _0 o7 r) I确实会有这种情况，但是茜素红染色很怪异，摸索起来很心痛，时间战线拉得很长——诱导的细胞我用P3代（原代8-10天，以后3-5天传一代，到P3代得20天左右，诱导还得21天）
+ r% A( L; t) c2 T上一次诱导染色，用了师姐配制的较高浓度的茜素红（2%浓度，过滤）染色，时间10分钟，会出现茜素红沉积（虽然过滤过），并且很难洗掉。这次诱导染色，1楼的第二张图片就是染色时间过长，导致冲洗不干净。附加一张上次的染色图片（很不成功）。

ljs

1.做实验心痛没有必要，事先充分的准备、多动脑、多动手才是关键！1 j: {# v1 S4 C0 [
2.无论任何理由，只要你想，就可以缩短时间，P1、P2为什么不试试？缩短时间，建议如下：/ ^) g4 l# a5 g, F6 j9 Q4 f% `
（1）用传代的方法来纯化骨髓间充质第二代就很好了。
% a8 ^8 t( J' ^  V（2）做诱导时可以多设几个孔、板子，一个不成功，可以再试！
4 }9 D" n5 r* _& T6 Y（3）楼主查查茜素红的物化性质，很可能是有机试剂，如果是，试试丙三醇、乙醇等等来溶解，染色失败的孔、很难洗掉的的沉淀都可以洗掉。
$ F  @$ S, L$ R0 D8 P3.针对过滤后、染色中出现的沉淀，建议避光；稀释染色剂的浓度，提高染色温度，延长染色时间；用有机试剂溶解来解决。

kgx1986

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从你身上学到很多东西，你的指导对我和大家都有很多益处，以后遇到疑惑还来论坛求助，恳请多多指导

可怜的孩子

茜素红染色，个人认为有三点很重要。一是茜素红的来源，推荐使用Sigma公司的；二是茜素红的配制，浓度和用溶剂；三是染色的时间。建议将培养皿和板扫描，不要镜下拍照，和不诱导的对照组一比较就看出来了。