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本帖最后由 细胞海洋 于 2012-1-11 01:03 编辑 ) a0 g5 g8 t0 B" q* ~! V, N$ `- U; S+ w& U
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【方法】条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统在神经科学研究中的应用
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Cre重组酶和LoxP序列
2 J0 s7 D- @. p) q" D# d# z+ \ Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。) d; d( G+ a) v; H/ X1 ]
LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：1 Y* B+ F, h* Y" f$ U3 L& i
5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'
: R" D; n( k; c8 S; h. ~+ S# Z 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
0 S/ m$ ~+ c' _[编辑本段]Cre-LoxP系统的特性
! t$ m! c/ q2 _% {2 [( p Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：
5 \) z' d/ d% d( b$ P; x 1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；
& ^! X+ k6 \* p4 e" B/ p 2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
) z, l% v" z7 ~ 3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
, n; n" U1 ]: s- U+ W. g% X1 C 另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
; M" B* I3 @& b4 n. G4 }# p[编辑本段]Cre-LoxP重组酶系统在基因打靶中的应用策略
4 c$ Z0 I9 z, `2 d1 P, r- P 基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。
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发表于 2011-6-2 10:40
