请教大侠们，有关条件性cre重组酶基因敲入或敲出小鼠制备的机制、原理

maomaoma

请教大侠们，有关条件性cre重组酶基因敲入或敲出小鼠制备的机制、原理3 z: |  e" g9 H9 f8 }- s8 `
网上看到的大多是knockout的示意，那knockin的与knockout的主要区别、方法有何不同，不是太了解，请各位赐教了，谢谢！

elvenchiu

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4 S6 o/ E3 t: Y+ f% a( y, m【方法】条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统在神经科学研究中的应用 % \9 Q% R. H$ n, G3 i1 ^  k
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Cre重组酶和LoxP序列- s$ ~* n& B2 P% b- K
　　Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
* K5 @% @% \6 L" g% X　　LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：
+ l2 k& j. Q3 }  X2 H4 s　　5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'6 R1 h5 K" f" j3 n
　　3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'$ {( z$ @0 |- l& p9 s! l! q
[编辑本段]Cre-LoxP系统的特性7 i# L* P8 U$ t# m
　　Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：! Z/ C4 r2 R+ H7 ~9 k
　　1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；6 [* t4 g6 m- W2 N2 F
　　2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；
" f7 _8 _# ~! y' C0 j# O　　3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。9 r9 d. T; r9 C7 ]
　　另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。' q. B- Z7 U& H$ o4 D; t) A
[编辑本段]Cre-LoxP重组酶系统在基因打靶中的应用策略0 o& a/ d, E8 b5 J; {% R5 Z, B
　　基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。或者将Cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除（诱导性基因敲除），实现特定基因在特定时间或者组织中的失活。 ' @2 U4 t, b/ s4 M3 u6 M7 |2 c

llecstem

所用的原理都是同源重组，knock-out是同源重组后使目的基因失活，而knock-in是通过同源重组的方式将标志基因整合进目的基因的某个位置。在载体设计上knock-in和conditional knock-out比经典的敲除要麻烦一些，要考虑插入位置和promoter的问题

liangxiaolei

回复 llecstem 的帖子, u$ m: `: Y+ |! T/ H. e% r$ i
3 J# T5 a% Z6 n( u) o6 u
你好，请问能具体说说插入位置，以及promotor考虑的原则吗？
* d/ Q0 A( q6 K我现在也在考虑做knock in，但是有好些不明白的地方，如果我想把cre放在某个基因的promotor控制下，那么该插入到哪里啊？有的文章说将cre插入到基因的起始密码子后面，这样的话是不是导致这个基因失活了啊？) {4 t% p8 S# c+ r3 V  D0 @. J
谢谢

tanguixiang

你到图书馆去借一本书看看不了解的更详细吗？或者自己去网上买一本* x; r, A( ], t
有专门讲转基因的书，中文的，图文并茂很不错的

llecstem

回复 liangxiaolei 的帖子
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$ y1 u) h. l" f- d我没做过Cre的小鼠，Cre的小鼠都是买的。现在已经有非常多的不同基因下的Cre的小鼠了，一般都可以找到你需要的，除非你要的基因非常特殊。你可以到南京模式动物中心去搜一下看是否有你需要的小鼠

maomaoma

谢谢各位！