单个核细胞分离无白膜层原因

zhuzhentulip

        我用15ml离心管分离5ml稀释全血（1：1）Ficoll分离液2.5ml，稀释全血与Ficoll分离液的比例是2：1，2000转20分钟离心，能得到较清晰的白膜层。后来我要分离50ml稀释全血的单个核细胞，分为4个15ml离心管分离，每管加Ficoll分离液2.5ml，稀释全血12ml左右，2000转20分钟离心，这样经常得不到白膜层，偶尔可以得到白膜层，是不是Ficoll分离液太少了啊？是不是Ficoll分离液与稀释全血的比例要1：1到1：2为宜呢？9 c0 J- B/ p3 W5 j  u0 Y
    如果用50ml的离心管来分离单个核细胞可以不，有人说液面大了分离效果不好，如果我用2支50ml的离心管来分离50ml稀释全血（1：1），每管25ml稀释全血，加到12.5mlFicoll分离液面上，Ficoll分离液与稀释全血的比例为1：2，2000转20分钟离心能得到较清晰的白膜层呢？

meixue1130

应该是分离液太少。我们一般用的是1：1比例的。. [/ ^) }2 T+ L
50ml 离心管可以用来分单个核，只要条件摸索好了，白膜层一样很清楚。你说的条件应该能得到白膜层。但是不同的离心机分离效果不一样，如果分离效果不好的话，你可以在这个条件附近进行变动得到最好的分离条件。* c! F! k! \/ K' R

easternliu

我们就是用的50ml离心管，FICOLL：血 1：2。感觉分离的关键在加样和离心降速，加样要45度倾斜匀速，不要破坏界面，离心降速降到最低，高速停下来过程很重要。

莫邪小仙

分离液2.5ml 全血就加12ml？！这个 你买Ficoll的时候没有说明书吗？即使二者比例不是必须1:1 1:2 但是这个1:5的比例还是太小了点，一般的是1:2或者1:1.5 再者我们分离的时候是用的50ml的离心管，效果挺好，若是血量多，一下子八九十毫升用15ml的管得多浪费。。。。你说的那个方法可行，若是效果不好，可以提高离心力或转速 2500r

Jonathan

我们是用PBS来稀释全血，1:1. 然后每个15ml管里面加4ml的ficoll，然后加缓慢加血到15ml。一定要慢，才能形成很好的分层。这样保证没问题，屡试不爽

lazyworm

分离液确实太少了，血：PBS按1:1比例稀释，混匀后缓慢地加到同等体积的ficoll上。离心时间和转速可以根据离心后的效果摸索，比如说离心完后看到白膜层与血细胞层之间还是红红的，就可以提高转速或者多离几分钟，如果说离心后看到白膜层不厚，而且下面的液体也很清，就可以减小转速或者减少离心时间。

zhuzhentulip

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谢谢你的回答

zhuzhentulip

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' q+ w$ b( L& m$ R. q% G$ @6 B5 b我们还是把减速设的0

zhuzhentulip

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" i( |( |! x; X* f. C实验技师给我们说的那样加Ficoll，但我在网上查了，也看了说明书，上面都是说的1：1或者1：2。所以就纠结了。

zhuzhentulip

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/ ~1 f* @+ F" Y: U9 z/ G/ S, i我明天就按12.5mlFicoll加25ml稀释全血用50ml离心管分离试试，我想应该可以的。