MSC诱导分化专题

dfe77

胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化# |+ Q* p& i' R0 [4 R
1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。
$ T  N, B' G% ?- `# l2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。. c3 I( T( e4 H$ \
3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：2 [  [1 r. S+ e+ F9 W+ d. d
一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；; S" A/ V+ Z+ o" r; b( }% n
二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。
3 N$ I& }' D. g; C) B37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。
9 O2 [1 R" U/ R$ B4 `4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。
- S0 s! W1 F7 C1 Z5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。3 u! r9 F* ~- c1 u  {! T

: s: t0 ~0 N' i参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas.
( Z) {/ H5 E0 x' ~/ Z* vBiochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

dfe77

deathdriver. o' d* A  h7 m9 U$ y: ]
我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：/ m* z' J5 }& |- ~, Y6 Q& _
Osteogenic differentiation.
8 j4 x2 k! V; R0 M1 v- w0 kThe culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.. U8 Q7 \2 B. e) Q( Z: Z9 J. Z; O
Adipogenic differentiation.
- Y7 k# }. K( T& HThe culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.: ^% V& @. d% n6 V8 G6 y1 b2 G
endothelial differentiation of ADAS cells.
) `& _% w+ l% e7 C8 HTo analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

dfe77

MSCs向神经细胞的定向诱导分化; l4 k1 W" m" s( r9 J( ]& t
MSCs向神经细胞的定向诱导分化
; c6 P( U; K6 |- j% X3 ?; s: V9 }
. _9 W$ G! \: T& p4 a9 a1 B  y2 U4 R一 MSCs的培养和纯化
- l4 z% W% O% j/ w二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化
9 F% y" W; T4 z6 k传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。" J' U4 s! G# C& U
三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定
9 k& S# d- J: ^3 _: N" N免疫荧光法详细步骤如下, X/ h$ p; H9 p- w- W3 g5 l9 w( S
①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;) T  H1 c2 ^8 g  t
②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
7 |" W/ h' m/ d1 O, G③用0.4%Trixton-100透化15min。
5 f# h- Y! @' _% N3 c% @6 n. D% p④10%BSA封闭1小时。
; U- t; u* E6 {( w5 i⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。
8 S9 U% ?. H# s, }% f9 J7 [& Y1 k9 O⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。
7 D" k$ O) F9 ^0 J8 `0 F, t; J8 p⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。
. Z* Y1 i  n. \9 d0 W⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

dfe77

贡献一下我的向造血分化的培养体系：. T# ~# j9 P3 J3 |& F# t7 x( X
造血干细胞的诱导培养
$ n' k$ ~; v$ x" V" |. t- T0 g试剂：
7 O" R5 Y$ p' b- U1.  淋巴细胞分离液8 T) E+ w& K. f
NaCl  4g
" U- a3 S* @8 m, E7 w! [2 fKCl  0.1g
3 ?6 ~' {3 R& }9 |* zKH2PO4  0.1g  }& D( N% u% L% u5 k* Z
Na2HPO4-12H2O  1.425g8 g8 {% b/ F5 j8 V. h, a
2.  PBS 500ml! d& m% l' _% W; M9 P& M- k( u/ e8 J

* p5 h! h6 S4 {& K8 w" n3.  进口胎牛血清
8 k4 @+ `/ T+ d8 }5 k4.  IMDM培养基
5 \' B" _4 ]/ F, F* ]) e5.  2.7％甲基纤维素3 w8 x7 E7 V: k& X7 n3 [- N
  配制方法一
& Q8 [3 R# m" u* H1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。
$ X5 y! H6 j. E2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。
0 ~9 m' A7 H" M- C$ c/ S3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。9 ]' D2 i! [5 s% W0 w
4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。
, K- j, ?; {- m  U  [/ {5)加双倍浓度培养液125ml。
6 ?! D+ n0 l. x! K# B! i6)加10％NaHC03若干调节pH至7* n/ q+ F( }$ G6 b1 Q& K+ j
7)分装若干小瓶备用。
! C% }8 {6 ~! H4 l  配制方法二（多选此方法）
9 s7 Y8 y% x( T: d" Q) k8 a1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。, C! V, J+ L& p( ], [
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。
, x- N- Q3 Y+ e% I3 x. Z3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。! Y- D* q0 m: D- |) C6 ^/ L
4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。
$ \) e$ v& D) ^, x- D5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。4 h% |* M/ a' A" Y: y7 g
6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。
4 u6 |( a# U8 g; p1 L3 X6.  牛血清白蛋白组份V
) \4 k- ?" E$ X; t$ H# c牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。0 n/ G% _- s8 ^" t% c
(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。4 a* F, _9 A" h( S
(2)配制步骤1 x9 ]6 y' z+ H# w# F9 c
1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。) ]! B9 E6 i; X9 e: P3 F0 B; v
2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。
/ W4 K  P- N" D5 d3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。, ~2 Q+ ]9 n$ G* k2 _+ Z% W
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。
' F3 M) M8 L5 N5 K- S- i5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。+ L% J. c  b) s" f* c' ]6 l
7.  β－巯基乙醇：1000×, B- |6 i- n5 m. u
8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml  H- W2 x9 h/ Y& ]/ Z5 m" ?9 _
9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln
  m+ {% q' t2 a- n+ h10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml5 ]  L5 y" x6 {  O! r
10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃
1 }! I$ H5 v; c% }11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）5 M& |- O$ e+ m
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml
& x1 J* b3 Q2 N: J- a' S4 Q  `13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml8 [( t$ r! ~( m" n. p
14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml) N4 L; m. p' V9 h5 K4 S8 \1 j" }6 s
( ^: H) Z% ]( d, I1 r. `
细胞因子的配制
/ g6 Z4 _) d; h' R3 @3 ]4 w5 w; x" _! `
细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度' z( z* B0 E& L* ^7 i* r8 D# X
IL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml) N" f& o5 [( ~7 i; L9 E8 @
IL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml' F; m" k- o$ U  c& ]! J4 v1 t
SCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml* f9 M: [" I( Q4 Y5 e% u! S
EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
( g% @# U8 D: V* A/ ?. qG-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml) R  m6 \! V/ Z  V
% B5 G: V; S4 m$ [* y1 L/ T
IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度% o# S3 B/ ]: P3 r

$ O4 T3 R# a6 @! e- ^IMDM培养基  30％% {; I- e* X* {% {) Z
进口胎牛血清  30％
) d4 K# L0 R3 @7 `  C甲基纤维素  0.81％$ e8 K# U/ f& v" N$ ~. T: M3 R
牛血清白蛋白组份V  1％) @2 Q. S# E7 T& J0 ]
β－巯基乙醇  0.1mM
/ z' j6 B. u% N9 R  a青霉素  60mg/ml
( R9 M3 O" q7 u# t  m- l链霉素  100mg/l
5 \5 [5 k6 [# L5 h7 v, QIL-3  2ng/ml% _9 C' B+ n) v* i
IL-6  20ng/ml
5 a% w/ [, }! r; U  Z5 W  M% uSCF  100 ng/ml
8 Z8 _0 ]8 O' ^2 d* X: g2 n' D' qEPO  2U/ml. U! a  a- E1 t$ z: E6 z1 J. ]
G-CSF  10ng/ml  V; k$ x0 o) w! I" N3 w
Gln  2mM
. |/ E+ Y2 Z+ q3 A# R/ S
" H8 p+ S% F7 K7 ?# F$ K诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）
9 b  @% }! `( S; u. c7 T2 `9 L
! W' V) y1 H5 H5 b向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导7 R6 a" O/ i7 \; C. T3 I
IMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml
3 z* X. ~3 p: `' |" ]+ G进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml
; M- P7 C4 x$ E( G4 F( I2 ~( `10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml$ C2 i6 ]( w8 z9 }/ Q
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl
- s+ ~' D5 H9 GIL-3  5μl  5μl  5μl
  _3 e* G+ {5 O7 e0 s7 ISCF  5μl  5μl  5μl
2 D! V* p$ r+ XEPO   20μl     
; M& P& d* C- c! bIL-6     5μl  
  J  t" d, x2 B/ KG-CSF        5μl
( j: A; k% ~7 P& d100×Gln  50μl  50μl  50μl
3 ?) z+ b5 F% l+ A) k500×双抗  10μl  10μl  10μl3 q4 T2 g# U' m: T6 k5 d
2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

dfe77

骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养
  l  `6 _* G- X1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以+ o! w* h" ~, |) m, x. H
10 5／ml接种传代。
; p5 U% d# R9 J. X8 [$ R% }0 ~2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

dfe77

成肌诱导
1 I. b) V* U- P& b  P7 F2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。
- n% ^( x9 m! X  M4 F0 b' ~- @# d4 E( X- `- N4 |5 p3 \4 x' X
内皮诱导5 B4 w; K( |4 U+ ^
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

dfe77

脐血干细胞向软骨细胞诱导分化8 B' F, z& z2 H( G% s/ t
选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。
8 M. f& Q& N; j2 W8 q) V不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

dfe77

羊水来源干细胞诱导分化4 O% |0 \/ T8 d! \0 T
1、羊水来源间充质干细胞
) |7 b! S  f; ]& {; p; v  S8 ?0 Z地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
; b1 p" l% l  R" b2 m地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞
0 ?+ E& ~! L0 j* O( j; ^成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞# g8 G8 N9 I! ?5 r8 U" ?
  D% ?' y6 X4 f  \7 U/ ~6 a) {
2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）: K) x' E3 n% P" d
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
" A' J7 n; N& N, b4 I地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞6 t/ I, F( U" i' \9 [# D) W1 t
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞
+ p# l! C* X. J' G' {bFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。
/ ^* ^8 U  y! `/ b/ N3 D6 C
5 l+ e- D7 I; m  Z# w% f+ h- n3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells
/ O4 X8 a( l9 N. V0 D( }地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞( b9 P0 Z1 K: a" w  m' ~2 [" s
地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞8 P3 x' p& {& m8 I1 w% G
5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞, m* |  G# ?  [
内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞* H  H5 g& t) [$ a# F& i) g
二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
- X% c/ B  N: n. R$ Z( u5 T- ]2 N二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞+ G- F- |! |' F! k

* R, k! r2 E. {; Q参考文献：6 d2 k0 e: T" G, s& U* _& J
1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.. a7 m' I( f( z0 N
2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.
* A# v, T. M% {( B3 e9 Z- U3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

yuheng

dfe77 战友辛苦了，这些很有用。" \- U& y& g  E7 k% t, r  B3 Y

8 r/ ^! x# n/ R( V如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

kqyy

xuexiliao