MSC诱导分化专题

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胰腺干细胞（SP细胞）向胰岛β细胞的诱导分化
5 I. x' l9 C5 R1.实验对象，选用3-7个月流产胎儿，实验选用的培养基是1640，并加入10.0 %的 FBS 和2%的双抗。$ t3 I1 J4 W3 _2 p( A, E
2. 胰腺干细胞的原代培养方法：用眼科剪将胰腺组织剪成1-3mm3大小，200U/ml胶原酶Ⅴ在37度消化5分钟，然后用冷的HBSS洗涤俩次，在培养瓶中放入含有10%的胎牛血清，10mM Heps，1mM 的丙酮酸钠和71.5uM β-巯基乙醇的1640培养基中。96h后,吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs),培养在一个新培养瓶中,换上新的培养基,添加20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF， 在24小时内ICCs贴壁。
* a# C6 w, Y# x. m8 U& ]0 A- }3.Hoechst33342染色：细胞传六代后，选用对数生长期细胞，实验前一天换液一次，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化液1ml，镜下观察细胞变圆，加入含血清培养基中止消化，吸管反复吹吸数次，脱壁形成细胞悬液，移入无菌离心管，计数，室温1000rpm离心，用含2%小牛血清的的1640培养液重悬成106/ml细胞悬液。细胞分为两组：- U5 b6 I3 v# g
一组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml；8 f6 t% C% A8 i* P( _4 P
二组：Hoechst33342至终浓度5μg/ml+维拉帕米至终浓度50μg/ml。
. e7 l* K, l9 R. ]6 \: A9 F37℃ 水浴90min，每15min混匀一次，冰浴冷却，4℃离心，弃上清，用含2%小牛血清的PBS洗一次，重悬于冰冷的含2%小牛血清的PBS中，两组分别加入PI至终浓度2μg/ml，细胞过滤网过滤制成单细胞悬液后，立即流式细胞仪分析。在左下角可见一群细胞两种荧光强度均很弱，即为SP（side population）亚群。8 p+ |6 H. H) W4 s  N7 r
4.单克隆SP细胞的培养和分化：单个的SP细胞和非SP细胞通过FACS被分选到96孔培养板，用上述培养基加 bFGF和EGF培养。培养七天后测定克隆形成。集落被迅速的传代，当这些细胞在传到第十代时，对其进行诱导分化。在诱导中，加入诱导液Ⅰ：无血清培养基 +100pM HGF+2nM activin A（苯丙酸诺龙）+500pM betacellulin（beta 动物纤维素）+10nM exendin-4 （胰高血糖素样肽）+10mM nicotinamide；当80%细胞融合，更换低糖培养基，细胞被进一步培养六天。
& Y* v" O% q, K, r: ]* X5.当细胞铺满瓶壁，加入制备好的DTZ工作液，37℃，培养15min。PBS缓冲液冲洗，显微镜下观察。若胰腺干细胞已诱导分化为β细胞，呈棕红色。染色完毕，加原来的诱导培养液，5h后，棕红色消失。
' ~3 ?- Z* v0 `0 X( A* a
7 h; ?4 Q6 d& M5 C: a! p6 ?参考文献ing Zhang, Jiang Hu, Tian-Pei Hong,et al. Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas." ]3 Y+ j/ t4 \6 I& Y% F2 V& K
Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 333 ,603–608.

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deathdriver
' B1 E  z( a1 F6 J我们实验室的前辈做过向成骨、成脂和成内皮方向诱导，引用一下他们的方案：
  m4 s0 y. |7 @7 g! `Osteogenic differentiation.' F" L# M, M% p+ p
The culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced in the following osteogenic medium for 2–3 weeks: Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 10 mmol/L b-glycerophosphate, 10
7 mol/L dexamethasone, and 0.2 mmol/L ascorbic acid (all from Sigma). Then the cells were stained with von Kossa to reveal osteogenic differentiation.
5 p3 |' w0 I8 Y. KAdipogenic differentiation.
6 h7 r' U$ f+ r0 [) HThe culture-expanded cells at 2×104/cm2 were induced for 3 weeks in DMEM supplemented with 10% FCS, 0.5 mmol/L hydrocortisone, 0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine, and 50 lg/ml indomethacin (all from Sigma). At the end of the culture, the cells were fixed in 10% formalin for 10 min and stained with fresh Oil red-O solution (Sigma) to show lipid droplets in induced cells.
5 M0 S& g1 D/ j. k4 E! ~endothelial differentiation of ADAS cells.. `) B; G* a* ]2 r0 h7 I
To analyze in vitro endothelial differentiation, a 24-well cell culture plate was coated with Matrigel (8.8 mg/ml; BD Bioscience Biotech.) in each well. ADAS cells were suspended in endothelial differentiation medium at a concentration of 1×105/ml and 0.5 ml of cell suspension was added to each well. Differentiation medium contained medium 199, 50 ng/ml VEGF, 10 ng/ml b-FGF, and 3% FBS. Cultures were incubated at 37 C in a 5% CO2 humidified atmosphere for 2–3 days observed with an inverted photomicroscope

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MSCs向神经细胞的定向诱导分化% U( p( h, d% D( L* R- n9 k& K& p& j
MSCs向神经细胞的定向诱导分化
# f8 S# V; v, H" u4 d8 {
$ s1 l) S& M/ C5 l# T- J% ?一 MSCs的培养和纯化
% H  ~. k2 L9 ]+ j  d二 MSCs向神经细胞的定向诱导分化
4 e- |1 Z: y) A# I% m. T9 b传至第5代的MSCs按1x104/ml浓度接种于铺有2玻片的6孔板中，制备细胞爬片，培养液改用DMEM+20%胎牛血清，待细胞融合达90%后，吸出培养液，用PBS清洗细胞两遍，后分别加人以下诱导剂:MT(10mol/L)、bFGF(20ug/L)、M组不加任何诱导液。逐日观察细胞形态变化，并分别于3、6、9、14天取出细胞爬片作NSE及GFAP抗原鉴定。' x9 B- w' x9 P; Q
三 诱导细胞的免疫荧光法鉴定
5 G7 e0 D1 B! z. H4 w6 ~& _& O9 }免疫荧光法详细步骤如下+ U$ q' w% p5 P' N. ^. n) K
①将细胞爬片取出后用PBS轻轻漂洗3次，每次1/2-1min;
- @3 x3 R# A: r7 @. M0 y' C5 g  [②甲醛固定30min，PBS漂洗，每次5一10min，共3次；
  r8 k9 Y0 y7 y" h4 K" b, P③用0.4%Trixton-100透化15min。3 ?8 p& q& b# e! ]. S0 N& ?4 v' E
④10%BSA封闭1小时。  u# l" t3 N4 i& {2 v. E8 T
⑤于盖片上加1:200PBS稀释的一抗(NSE、GFAP)，室温孵育1小时。PBS漂洗3次，每次10分钟。6 O$ l! L! ~7 [
⑥避光室温下加1:100稀释度的荧光二抗孵育1小时，避光下PBS漂洗3次，每次10min。ddH20洗1次，5min。
" ^8 s* ~( j' |" \2 ?⑦95%甘油(ddH20稀释)封片。
, t/ D. T2 v- f& e: L" V⑧荧光显微镜下观察结果并拍摄照片。

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贡献一下我的向造血分化的培养体系：
0 X8 _2 W, v% W) j, x" y造血干细胞的诱导培养
5 m6 F0 a1 R1 U% c. n试剂：
7 M) \& a8 ~9 @7 z) @9 _% _9 D1.  淋巴细胞分离液
( O3 Y# g: k; a7 S2 w: |NaCl  4g* ^% L8 ^: L  v: S% R% r: W
KCl  0.1g8 H8 g3 @- C# l9 I3 m- K
KH2PO4  0.1g
, g) u8 G  ~( P) D& S/ ZNa2HPO4-12H2O  1.425g
+ N! \0 d/ E0 g2.  PBS 500ml
  ^+ _7 r" q9 m) [( e7 H! L, M1 e& |* D$ w; B% E
3.  进口胎牛血清
" ?* g8 H* a6 F8 W4.  IMDM培养基+ o& l6 E+ b* d. _# ~& D
5.  2.7％甲基纤维素: e' y2 f9 n: t. t, S8 _3 p
  配制方法一
2 I0 _1 \9 G  g* o; k1)将甲基纤维素6.75g平铺在直径为10mm的培养皿内。4 c5 ]9 T7 F. \  Q  S
2)用紫外灯照射甲基纤维素24h后，在无菌条件下，将它放在烧瓶中。1 J- {. f) K6 |( X( I# a+ J2 h
3)加消毒过的双蒸水125ml，充分振荡30～60min。
6 w: H- H6 N0 H! Y( t5 F) L4)置4℃冰箱内24h。气泡消失。+ v' u4 t0 X" Z) r) m0 p9 @$ Q) i
5)加双倍浓度培养液125ml。" Y, r& q2 ^. E
6)加10％NaHC03若干调节pH至7; ~+ \, x4 H! }& R$ ~
7)分装若干小瓶备用。# i9 B8 R, Q. A! q+ J) _* J* F  J* |
  配制方法二（多选此方法）
3 I# `7 F$ z4 p4 G1)称取甲基纤维素6.75g，放在500ml三角烧瓶中。' q7 ^" _) B' u
2)加双蒸水125m1煮沸。用磁力搅拌器不断搅拌使甲基纤维素充分混匀。% L% C2 x0 w" r# t( ~+ a/ t9 K
3)继续煮沸15～30min后，置室温下冷却。
# E: [1 N& N: e3 Z, A, Z4)加双倍浓度培养液125m1，反复振荡。
& q4 l/ q4 X) v# X5)置4℃冰箱中。约每隔10min振荡一次，2h后置冰箱(—20℃)中冰冻过夜。
7 V$ r0 _4 Q1 w/ R$ ]8 m6)从冰箱取出后于室温融化，分装。于4℃冰箱内保存备用。
* i1 \  o1 L5 i1 L% J6.  牛血清白蛋白组份V$ s# g( V$ z. }
牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)主要用于红系、巨核系和混合集落的培养，加入一定量后能明显增加培养效果，但配制不当就起不到这样的作用。一般工作浓度为10％。0 O! d5 S+ x& X! V
(1)主要材料：包括：①牛血清白蛋白，纯度为98％～99％，不含主要脂肪酸和球蛋白，含氮15.6％。可选用Sigma公司编号为A-7030的产品；②混合离子交换树脂AG501-x8(D)；③Dulbecco磷酸缓冲液(2倍浓度)；④双倍浓度培养液；⑤G-5漏斗或孔径为0.45μm／ml 的微孔滤膜；⑥双蒸水。* Y0 H' B& ~' O) `9 M
(2)配制步骤1 J; X  R; X" ?2 ~: y
1)将5gBSA用9.1m1蒸馏水在离心管内溶解。用磁力搅拌器搅拌，经2～3h后才溶解。
& ?, Z" W5 m/ h" v3 k2)将1g AG501—x8(D)加入离心管内，置4℃冰箱内，每15min搅拌1次。2h后离心，取上清液。或再加1gAG501-x8(D)，重复离心1次，直到离子交换树脂不变色。  L+ b: k, W4 b$ O# O5 b" e+ D
3)用Dulbecco磷酸缓冲液(2倍)稀释至10％。# b$ D* Y% r) \% z5 F! a
4)用G-5漏斗或微孔滤膜过滤除菌。! g+ k, v# d, j: \4 ?
5)再在每20m1 10％BSA中加入0.5m1 7％的NaHC03和0.2ml 3％的谷氨酰胺。6 t- J! x/ p; D& S
7.  β－巯基乙醇：1000×
7 h. j+ w/ G8 q' x7 Q& A8.  双抗：500× 每16ml需要青霉素80万单位，链霉素800mg 即青霉素5万U/ml，链霉素50mg/ml
$ |0 r6 O' Q* n* e" k$ _! G( {2 @: X9.  Gln： 100× 每100ml需要2.927g Gln
# h4 H3 r2 j# Q7 P3 T10.  IL-3：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml# S$ g; m" F" U# R; @4 B
10mM乙酸：取12μl纯的新开封的冰乙酸加20ml灭菌纯水混匀后过膜除菌，置于4℃
5 [7 f) d" @) T& F/ V11.  IL-6：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～0.5mg/ml（轻摇溶液使之更好的溶解）: j+ F7 k0 B" q$ P
12.  SCF：用10mM乙酸重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml8 l7 e5 E, z& N) j- `! C
13.  EPO：用含至少0.1％的人/牛血清白蛋白的PBS重溶至终浓度大于500μ/ml
* |. \) `+ J6 y/ F  k14.  G-CSF：用水重溶至终浓度0.1～1.0mg/ml5 }+ z7 x4 `- N9 V
4 U: Y8 H3 e3 i, i& y
细胞因子的配制
! s# k5 E4 l7 \* m5 O2 V& {6 w- s; f- z8 `2 R) ?
细胞因子  储液浓度  储液配制  稀释倍数  终浓度
3 H; {! M4 C5 j' ]5 M$ n" N. fIL-3  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  50  2ng/ml4 Y8 G- X$ O3 W; Q# p% D
IL-6  0.1mg/ml  5μg加50μl 10mM乙酸  5  20ng/ml
8 J) g1 v0 H( s& lSCF  0.1mg/ml  10μg加100μl 10mM乙酸  0  100 ng/ml% W9 [+ Q5 q7 M  @. U
EPO  500U/ml  加900μl PBS及100μl 1％的用PBS配的BSA  0  2U/ml
* O0 V* U( R& [: P8 s: I; |G-CSF  0.1mg/ml  2μg加20μl ddH2O  10  10ng/ml' I) F& l' K  c$ Y% i/ q6 U
7 k  Q2 c! r$ f+ K
IMDM-甲基纤维素半固体培养基的各组分终浓度
; J+ G9 v8 t0 \/ |
3 X2 `9 w( k5 Y0 c3 |; _7 UIMDM培养基  30％& H; s9 v$ N9 |% g
进口胎牛血清  30％
) k- @. W0 g- X0 L% d甲基纤维素  0.81％7 f4 D% i: J' K. Q# v# N
牛血清白蛋白组份V  1％
- C  l8 N  e' \, T0 }4 G& s$ f7 Lβ－巯基乙醇  0.1mM' E& `4 d3 T" g4 \6 {
青霉素  60mg/ml
, I: m( Z) d) ^* ~链霉素  100mg/l9 Z) Y, K8 D% t) J* r
IL-3  2ng/ml
4 T+ C" f" c/ p$ d* K: lIL-6  20ng/ml
* y- ]7 Y" U" |4 FSCF  100 ng/ml
+ }- }( O) C3 E6 z9 J6 q, wEPO  2U/ml
! ?5 f" K" c* L9 P/ v* V$ B1 {G-CSF  10ng/ml
* F* Q+ h% x' s2 X1 N3 EGln  2mM8 Y$ ^" J+ J, l) e
/ U! K0 Y+ i. x; c3 C3 ]) N( G
诱导（5ml体系，可以铺两个30mm的培养皿）9 K( r' Z4 S% I2 R3 _. M- k- b

1 R! _$ B6 o3 T" Q( C+ ?% z# f9 B2 v向红系诱导  向巨核系诱导  向粒系诱导
0 [5 `# G" K& ^5 t& q  wIMDM培养基  1.5ml  1.5ml  1.5ml
. G1 H8 I1 R2 Y. W2 ]) E0 _' Z. |进口胎牛血清  1.5ml  1.5ml  1.5ml8 d7 R8 k+ s3 a: Q! X
10％牛血清白蛋白组份V  0.5ml  0.5ml  0.5ml0 E/ l9 v, B* p% k$ G5 n6 I4 n' v
1000×β－巯基乙醇  5μl  5μl  5μl9 ?% k. P. B! s, p/ [0 G! o3 h+ d; z
IL-3  5μl  5μl  5μl7 b6 D' S: P9 D- d! L+ _7 Y
SCF  5μl  5μl  5μl
; o/ M- W% a) _: c6 tEPO   20μl     & Y, J! O4 V* `' q3 D; k, b
IL-6     5μl  
' o4 P0 _4 q# f$ {6 d0 UG-CSF        5μl
, n8 c8 D2 O3 n% T' W2 ?3 I3 ~100×Gln  50μl  50μl  50μl
! n1 E+ s/ F' \1 D  N! v1 p500×双抗  10μl  10μl  10μl
- ^2 J5 _& ]2 Z. B" u! v2.7％ 甲基纤维素  1.5ml  1.5ml  1.5ml

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骨髓基质干细胞诱导分化为雪旺细胞培养
( [& r) u7 h6 L9 p1．以无造血系统疾病的成人志愿者为对象，无菌条件下抽取骨髓4 ml，DMEM常规制成细胞悬液，梯度密度离心后，以1×10／m1个细胞接种于25 ml培养瓶，37度，5％CO2饱和湿度条件下培养，待贴壁细胞达90％ 融合后，以3 S! X( {- B2 I, m& s4 ~3 H( ?
10 5／ml接种传代。
- T0 U0 D1 V, b) S/ U7 W2. 诱导培养 去除培养液，加入预诱导液(DMEM，15％FBS，1 mmol／LBME，10 ng／ml b-FGF)诱导24 h，加ATRA，BDGF诱导3 h，加Heregulin，Forskolin，b—FGF，PDGF 37度、5％CO2,饱和湿度条件下诱导5 d

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成肌诱导/ Q. C. T$ Z$ t" L
2 或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。: D% ]/ K0 y% \2 `; w

  ~% p4 q0 P* g+ B9 I8 X. q内皮诱导8 o5 ]9 G9 j1 D0 a3 r8 @/ w1 Y
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。

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脐血干细胞向软骨细胞诱导分化
# i/ H0 C6 u- p选第5-7代生长良好的培养细胞，置于15 ml的聚丙烯管中，1000 rpm离心5 min，弃上清，,加入含血清软骨诱导液的培养基进行细胞诱导培养。, |  q; _1 M: N: q" x7 E' Z
不同学者采用的培养基和软骨细胞诱导液有所不同，Oscar K等在H-DMEM培养基中加入1μM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，100 μg/mL丙酮酸钠，40 μg/mL脯氨酸，10 ng/mL TGF-β1和50 mg/mL 预混的ITS＋（含6.25 μg/mL 胰岛素，6.25μg/mL 转铁蛋白，6.25 ng/mL硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35 mg/mL亚油酸）。Gang E J等则在L-DMEM培养基中加入1mM丙酮酸盐，0.1mM抗坏血酸盐，100nM地塞米松，预混的ITS＋和10 ng/mL TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。预混的ITS＋的成份及浓度跟Oscar K相同。

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羊水来源干细胞诱导分化
, B# X4 ?! v# m4 _3 p3 t1、羊水来源间充质干细胞
: \  g/ L4 j- j" W地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
5 }( Z/ E5 `2 M3 ?8 Z! p地塞米松、维生素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞
0 P  F3 |. s0 n+ W2 a- C成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇诱导其分化为神经细胞
' Y# S" z  o3 l' n
; _+ U6 O- E) W9 R2、HAFFTs（human amniotic fluid fibroblastoid-type cells）; T+ `- z8 w, D
地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
4 e, b2 n" v( L地塞米松、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞; T8 X. }* C) `2 {% A0 V
地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β等诱导其分化为软骨细胞
  v. C# B9 p8 b3 |# c7 IbFGF、EGF、二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚、KCl、丙戊酸和氢化可的松诱导其分化为神经细胞。/ G, h# c4 J+ T$ f+ d1 a
4 |1 }0 G# c6 c7 f0 i+ R. o
3、amniotic fluid–derived stem (AFS) cells3 W4 ^; H6 @& [6 z$ i" o
地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞
2 Z8 R, I- B  x9 n/ Z0 m地塞米松、β-甘油磷酸盐、维生素C-2-磷酸盐诱导其分化为骨原细胞  v' b( ^: O( W5 W0 l, e6 E
5aza-脱氧胞苷酸诱导其分化为肌细胞5 x+ H6 ~; f/ f
内皮细胞培养基+bFGF诱导其分化为内皮细胞3 L  q& E& ?: a; ^
二甲基亚砜、叔丁对甲氧酚和NGF诱导其分化为神经细胞
+ X# Z) X  q) r/ m* f; ^二羟基丙硫醇、HGF、制瘤素M、地塞米松、FGF4和ITS等诱导其分化为肝细胞
3 ~4 y. y4 \& U" N
% ^4 [( N  x; }5 e& x; Y: T参考文献：! N$ i) z4 Z# ?
1.Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum. Reprod. 2004 ,19；1450–1457.
- R3 j3 N) @. O7 a# d% F0 f2.Kim J, Lee Y, Kim H, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif. 2007;40:75-90.1 J$ d3 Y! G' ?  x8 R
3.Coppi PD, Bartsch G, Siddiqui MM, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotech. 2007,25:100-106.

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dfe77 战友辛苦了，这些很有用。8 }; q4 Y: Q% a/ g
9 E+ t4 i- e9 _- B
如果再结合自己的实验结果和心得就更好了

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