请教关于小鼠胚胎干细胞的培养问题

86964109

请教达人：( W' r' J, |9 \# t: h& L
1：你们培养ES多是直接购买细胞系还是自己构建呢？
+ o' U) V! f. H6 Q! S2：如果自己构建的话，哪种方法鉴定是主流呢，免疫荧光还是流式3 Y; T- \  R9 \* X8 B
3：还有该细胞的培养对硬件环境要求有多高呢，比如洁净度方面？
; X4 Y6 v* \" t0 J' @2 C% N, B4：如果培养环境很一般的话，胚胎干细胞有可能长起来么？
( I/ V5 ?: k# e( I9 i# F; U$ Q3 j0 @+ f; ^$ e
谢谢！

bj123

1.有购买的，也可以自己建系。
, f' _- @$ C) |, R4 s0 X& ]4 u: \2.鉴定还是免疫荧光吧，只不过是其中一种，像核型、畸胎瘤都要检测
7 u6 {  I0 A% {8 x* ^2 G: ?3.主要是有个密封环境，然后有个超净台即可
  d7 e' q0 U+ j5 V' x" i4.应该是没有问题。也有看操作人平时是否注意无菌操作即可。

86964109

回复 bj123 的帖子- h/ G4 R8 s- b

" N% [2 ~4 h0 }  @1 i- \谢谢，那么直接购买的细胞也需要检测核型和畸胎瘤吗？
9 S1 D. V1 r8 @7 R
! J# @0 Q' A* y' V5 ^; x# {另外，在文献中看到这样的描述/ V/ W$ n1 L# A9 H7 p6 r8 N

8 A4 B0 a6 w/ v8 T) e‘ES cells were maintained on mitotically inactivated primary mouse embryonic fibroblasts or on gelatin-coated culture plates’可以理解为胚胎干细胞可以生长在MEF的饲养层细胞上或者直接接种于铺有明胶的培养板上么，后者能很好地让细胞生长吗？另外一句“ES medium consisting of knockout DMEM supplemented with 15% FCS, 100mM MEM nonessential amino acids,......”是说ES培养基不用DMEM而用15%FCS、100mM MEM 非必需氨基酸...替代么？可是看很多国内的文献都是用的DMEM啊，有些不明白。
! n" k5 D1 F9 p, d3 V0 C附件是文章出处2 [4 Z+ ]& u( Z! j% x

; z) ?  g4 j2 t# S最后一直有件事想不太明白，如果用饲养层细胞培养mES的话，传代时怎么区分它们呢，还是MEF只用于ES细胞的最初培养，之后传代过程中不分裂而逐渐筛掉？那么丝裂霉素C如果处理适当是否经保持MEF的分裂抑制作用呢？

不倒翁

回复 86964109 的帖子
2 n9 q5 t: L+ f  {& N
/ I3 V) j# R3 a/ s% z5 c* i养ES的时候可以铺feeder（就是文章中说的秋水仙素处理后不能分裂的MEF），也可以包被gelatin，是两种不同的方法。一般来讲feeder上的ES长得更好，贴壁情况也更好。gelatin的话有些细胞系是不可以在这上面维持的。knockout DMEM是一种DMEM培养基

86964109

回复 不倒翁 的帖子
) |/ d# H* K$ {/ K; v6 X" L6 N, y3 X6 m+ X1 e
哦 是这样啊 非常感谢！

不倒翁

回复 不倒翁 的帖子( l4 v1 D- T/ k4 g
6 {. K0 Y" K3 g
我们一般就用普通的高糖DMEM，没有用knockout DMEM。关于feeder看你的实验需要。feeder上ES维持的状态会好一点，但是有些实验是不能用feeder的，所以就需要把ES和feeder分离开。用差速贴壁的方法可以将两者分离开：传代时，将消化的好的ES用ES培养基重悬，种到gelatin包被的盘里，贴壁半小时到一小时，此时feeder已贴壁，ES还是重悬状态，小心将培养基吸出，离心，沉淀即为ES细胞，feeder还留在盘里。如果想去feeder去的干净一点，可以适当延长贴壁时间。普通传代时不需要将两者分离，正常消化计数传代即可。

不倒翁

sorry，feeder是丝裂霉素C处理，不是秋水仙素 ，sorry

86964109

回复 不倒翁 的帖子/ s# y# n* p% c+ h1 G

& ]* [2 K1 c0 N好的， 大致明白了，可不可以理解为如果想维持ES增殖而不分化时，可以和MEF混合传代培养，当我想进行分化诱导时就要挑克隆，或者差速贴壁，把ES分离出来。此后培养在包被明胶的培养皿上，加入诱导分化培养基，进行后续实验？7 ~6 n& K1 c* g
' ?. o! q  {' O" u/ n6 I
感谢耐心解答，3Q！！9 c5 @% b1 G5 L8 b% V
  n# D5 G* u" P5 s" T

不倒翁

回复 86964109 的帖子
& ~6 M8 Y% T; j/ J1 Q" F! z& `1 v, s8 y. K
嗯 可以 铺feeder养的话要提前铺好feeder，至少五小时以前铺上，尽量过夜。密度要适当，以MEF铺展开来刚好能覆盖培养皿为宜。消化下来的细胞里面混杂的feeder占得比例非常小，普通传代时可以忽略7 f% Y- j: f) w

86964109

回复 不倒翁 的帖子
$ A$ Z; V7 l. ?+ B
2 w$ z) ~6 I$ v2 b: S* U5 J+ R: A好的，明白了，十分感谢。
2 ], G' F: T. `: n8 K# I3 @# x: J( h8 |. W+ i/ z
还要再研究下胚体是怎么做的，听说有悬滴法和细菌培养皿法，第二个有点想象不出来，不亲眼看操作，上手做一遍，只靠想象的感觉真难受...，