请教关于小鼠胚胎干细胞的培养问题

86964109

请教达人：
; \9 @$ c) z0 r3 J1：你们培养ES多是直接购买细胞系还是自己构建呢？
; }$ z" a, ^' n  w0 v2：如果自己构建的话，哪种方法鉴定是主流呢，免疫荧光还是流式8 x% K5 [& P6 z+ c2 j) J' [
3：还有该细胞的培养对硬件环境要求有多高呢，比如洁净度方面？* I8 `1 ~) v8 Y. E6 D
4：如果培养环境很一般的话，胚胎干细胞有可能长起来么？, h# n$ M. x; f/ r& h' \
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谢谢！

bj123

1.有购买的，也可以自己建系。9 x: F) l. \* q
2.鉴定还是免疫荧光吧，只不过是其中一种，像核型、畸胎瘤都要检测
+ P% d- O. Q$ K4 [8 m3.主要是有个密封环境，然后有个超净台即可
; S/ g* i3 A: y6 b4.应该是没有问题。也有看操作人平时是否注意无菌操作即可。

86964109

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1 T/ f# r5 p/ Z谢谢，那么直接购买的细胞也需要检测核型和畸胎瘤吗？; l* S* l( {  X/ I
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另外，在文献中看到这样的描述; j$ x7 K$ P4 I3 O
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‘ES cells were maintained on mitotically inactivated primary mouse embryonic fibroblasts or on gelatin-coated culture plates’可以理解为胚胎干细胞可以生长在MEF的饲养层细胞上或者直接接种于铺有明胶的培养板上么，后者能很好地让细胞生长吗？另外一句“ES medium consisting of knockout DMEM supplemented with 15% FCS, 100mM MEM nonessential amino acids,......”是说ES培养基不用DMEM而用15%FCS、100mM MEM 非必需氨基酸...替代么？可是看很多国内的文献都是用的DMEM啊，有些不明白。
* f. _4 B& {7 O2 @. d附件是文章出处
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最后一直有件事想不太明白，如果用饲养层细胞培养mES的话，传代时怎么区分它们呢，还是MEF只用于ES细胞的最初培养，之后传代过程中不分裂而逐渐筛掉？那么丝裂霉素C如果处理适当是否经保持MEF的分裂抑制作用呢？

不倒翁

回复 86964109 的帖子8 u- F. g5 F& J! n6 |7 Q" r' i
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养ES的时候可以铺feeder（就是文章中说的秋水仙素处理后不能分裂的MEF），也可以包被gelatin，是两种不同的方法。一般来讲feeder上的ES长得更好，贴壁情况也更好。gelatin的话有些细胞系是不可以在这上面维持的。knockout DMEM是一种DMEM培养基

86964109

回复 不倒翁 的帖子- u6 @1 V2 I& w0 ~- w$ X! S

8 [) V( E9 V  V7 ^# P' o哦 是这样啊 非常感谢！

不倒翁

回复 不倒翁 的帖子8 _8 [, c( O" G- @% Q

9 S  A& ]2 t; F# F7 U我们一般就用普通的高糖DMEM，没有用knockout DMEM。关于feeder看你的实验需要。feeder上ES维持的状态会好一点，但是有些实验是不能用feeder的，所以就需要把ES和feeder分离开。用差速贴壁的方法可以将两者分离开：传代时，将消化的好的ES用ES培养基重悬，种到gelatin包被的盘里，贴壁半小时到一小时，此时feeder已贴壁，ES还是重悬状态，小心将培养基吸出，离心，沉淀即为ES细胞，feeder还留在盘里。如果想去feeder去的干净一点，可以适当延长贴壁时间。普通传代时不需要将两者分离，正常消化计数传代即可。

不倒翁

sorry，feeder是丝裂霉素C处理，不是秋水仙素 ，sorry

86964109

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: a9 R% v* \) ?; c( C3 M8 R好的， 大致明白了，可不可以理解为如果想维持ES增殖而不分化时，可以和MEF混合传代培养，当我想进行分化诱导时就要挑克隆，或者差速贴壁，把ES分离出来。此后培养在包被明胶的培养皿上，加入诱导分化培养基，进行后续实验？
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感谢耐心解答，3Q！！
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不倒翁

回复 86964109 的帖子; r6 _6 }/ |1 V- [
5 O- m& M; g; h8 p( B8 w% y! ^
嗯 可以 铺feeder养的话要提前铺好feeder，至少五小时以前铺上，尽量过夜。密度要适当，以MEF铺展开来刚好能覆盖培养皿为宜。消化下来的细胞里面混杂的feeder占得比例非常小，普通传代时可以忽略
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86964109

回复 不倒翁 的帖子" N9 R+ s# q) j; T+ e
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好的，明白了，十分感谢。' g9 v, ]# W/ s3 w
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还要再研究下胚体是怎么做的，听说有悬滴法和细菌培养皿法，第二个有点想象不出来，不亲眼看操作，上手做一遍，只靠想象的感觉真难受...，