bMSC和成骨细胞的分离为何这么相似？

zhen022

小弟刚开始bMSC分离不久，有一些问题不是很懂：; M& L2 n  s* w  p
1、传统的成骨细胞分离方式一般是通过骨碎片爬细胞方法，主要方法参考一些文章（，为了方便就列出中文的“小鼠颅骨成骨样细胞体外分离方法的改进”），大致过程是取颅骨细胞，剪碎成1mm3碎片，直接接种或者酶消化后接种，然后让细胞爬出，获得“成骨细胞”。
! F7 D+ S! E) @但是看了一些骨髓来源间充质干细胞（bMSC）的分离新方法，主要有军事医学科学院毛宁实验室做的，发表于“Nature Protocols 5, 550–560 (1 March 2010)”，完成人是博士生朱恒，他博士论文中说的将股骨和胫骨的骨片剪碎，胶原酶消化后接种，让细胞爬出。
+ z. z1 Y/ O2 n  S! b! |4 @这两种方式很像，为何一个分出来的是成骨，一个是MSC？
( k( d: {2 z( @& {% W+ H4 ~* R; |" }  [
2、另外就是bMSC分离和纯化的方法，实验室移植采用骨髓法获取bMSC，主要是用培养基冲骨髓，然后接种，通过差速贴壁法获得bMSC。但是我看很多同仁，觉得这样MSC还是有很多杂细胞，想知道大家在这个过程中用的方法怎样的？有没有关键的步骤？

supercell

回复 zhen022 的帖子0 W; o8 C% u  H4 @" K
+ |( s+ s6 y/ r4 r( s& s
就你的两个问题：
2 K- v, |" T% J/ L; U! t: a: _1、成骨细胞本身就是间充质干细胞下游分化的一种细胞类型，加之目前原代细胞分离培养基本采用机械贴壁法和酶消化或者两者结合的方法进行，所以两种细胞分离的方法比较接近是自然的。( F1 Q/ x& A; B( W- K% @, z5 _9 ]
2、原代细胞分离都存在不纯的现象，所以需要后期优化培养条件进行筛选，所以不但要关注分离方法，重点还应该看不同类型细胞的培养基和培养条件。成骨细胞是较为成熟的细胞类型，所以培养基中添加Ga2+等骨形成相关的元素和细胞因子；而MSC作为成体干细胞生长维持则需要添加bFGF、EGF、TGFbeta等细胞因子。如果采用含血清培养体系，血清的质量和密度也不同，而目前也已经有很多商品化的无血清培养基。" }8 n, `% t  m! a
3、只要培养条件比较合适，在3代左右就能获得比较纯的细胞。

zhen022

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5 l: @! d0 Z; ]- Z
, h' @: Q9 S, |  `0 x# c首先感谢您的回答。
  n0 U0 `9 w' I% k. b5 o$ z不过干细胞生长要加的都是细胞因子，实验预算达不到啊，唉。
" @, W( E6 d' i4 _" Z另外第三天讲培养条件合适，具体指代那些，有没有可传授的经验或者文献参考？

supercell

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) b1 x! R- ~. T& i& {- @2 m8 e$ W) E
条件合适最主要的就是培养基，如果你做的是小鼠的BM-MSCs，参考毛宁实验室的protocol即可；如果你做的是成骨细胞，一般要加 sciencell 公司有商品化的Osteoblast Medium 。
) e! m* Q% C9 m' VProduct Description9 m: J3 T2 g8 K5 W8 [3 y
Osteoblast Medium (ObM) is a complete medium designed for optimal growth of normal human osteoblasts in vitro. It is a sterile, liquid medium which contains essential and non-essential amino acids, vitamins, organic and inorganic compounds, hormones, growth factors, trace minerals and a low concentration of fetal bovine serum (5%). The medium is bicarbonate buffered and has a pH of 7.4 when equilibrated in an incubator with an atmosphere of 5% CO2/95% air. The medium is formulated (quantitatively and qualitatively) to provide a defined and optimally balanced nutritional environment that selectively promotes proliferation and growth of normal human osteoblasts in vitro.) g; M* k. ?& _

; r8 d9 I3 h" g$ l* @Components) B0 M/ K; m- x1 {3 s
ObM consists of 500 ml of basal medium, 25 ml of fetal bovine serum (FBS, Cat. No. 0025), 5 ml of osteoblast growth supplement (ObGS, Cat. No. 4652) and 5 ml of penicillin/streptomycin solution (P/S, Cat. No. 0503).
: e  |. w) [6 c
/ T: }% k8 B$ o" UProduct Use
) s; e4 g$ Q# S$ p2 m% c; {9 N4 tObM is for research use only. It is not approved for human or animal use, or for application in in vitro diagnostic procedures.7 v: Q5 w7 l- c3 B, y+ @1 h9 e3 F8 h

8 c4 t- n: b; d- CStorage8 S# n8 J& [3 b/ z  q, w0 Q$ y
Store the basal medium at 4oC, the ObGS, the FBS and the P/S solution at -20°C. Protect from light. ; O$ b9 B* U  B! k6 O

& N  v4 `; y3 T1 P& e7 e+ }" PShipping
, |: x, y4 C! ]& Y  U- cGel ice.
* F: d$ ]* o+ G/ E) N
$ R2 i/ a$ G9 K8 o6 }) DOsteoblast growth supplement is also available for puchasing seperately
: |  j6 ]" J# B* W( x7 a
! G5 Z( H1 X6 q, |
3 H+ \( ~% [, s( Z" X. k

zhen022

upup6 c3 `$ Q0 C. v( @. {1 ?

267318024

确实很相似呢，是不是需要添加什么东西，听你讲的步骤基本没区别

zhen022

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/ `, ]: V6 d6 q% M& j) _4 S% ?; N
+ B! z) L9 o; d4 i7 R% B我没看出来多大区别啊，貌似培养基略微不同，这不影响吧

267318024

我养的也是BMSC 基本上经过两次换液后就比较纯了，不会有杂细胞了啊 我发过图片的 你可以看看

绝对忠橙

我觉得这两个问题：
0 O0 b6 f, Q1 @, C4 z1.因为股骨胫骨属于长骨，有骨髓腔，颅骨属于扁平骨，没有或者骨髓腔较小。7 E: e. o7 ^. o
2.你说的方法应该是全骨髓贴壁法，目前我也采用这种方式，确实存在你说的问题，因为培养基的成分不仅适用于bmsc，还适用于其他的造血干等其他细胞，我目前用的方法是冻存复苏，复苏后刚开始状态挺好，但是几天就不行了，不知道其他同学有没有切实可行的办法。

zhuheng

楼上说的不错，我们用长骨可以分离出具有三系分化能力的MSC，而用颅骨只能分离出类成骨细胞，成脂肪分化能力很弱的。