请教流式抗体的制备，谢谢！！

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    先介绍一下我的实验，我养的是兔的骨髓间充质干细胞，现在培养到第三代，准备做流式鉴定一下细胞，鉴定的细胞表面抗原是cd44，，打算用的抗体是抗兔的cd44，一抗是鼠抗兔的cd44抗体，二抗是FITC标记的羊抗鼠的抗体，现在遇到的困难是1：我的样本该怎么制备，就是一抗，二抗怎么滴加，也就是制备的程序?2:在做流式细胞之前，我制备的当天就可以做流式，做流式之前该怎么准备几管细胞悬液，就是阳性组和阴性组怎么准备，我不做同型对照。最近试验忙的焦头烂额的，比较着急，谢谢大家了！

leisong12

FACS Analysis( P8 Y* A! j$ m3 s5 ^- E
1.        1.     Harvest cell using 0.25% trypsin  
# ~! x4 ^1 L+ z- Y( ?2.        2.     Resuspend in 1ml DMEM/F-12 media with Trypsin inhibitor  细胞浓度为1000000个/ml! w6 N6 A$ k7 `' |; w
3.        3.     Placed in a 1.5 ml micro centrifuge tube and spin down  6 I2 L$ R  u8 c5 W' E7 T4 v
4.        4.     Wash with FACS buffer (1XPBS, 5% FBS, and 0.1% sodium azide) in ice ( U$ c7 o* }) B- }4 P
5.        5.     Resuspend in 50-100 μl and incubate in ice or 4℃ for 30 min ~ 1 hour with appropriate antibody (1:20-1:40 dilution)
; ?$ U4 Q7 Q& N( ~  Z3 G9 w6.        6.     Wash three times with FACS buffer 个人经验是洗一篇，洗多了丢细胞: w4 \' O) q0 p8 ?2 C3 e% R
7.        7.     Incubate with a flourescein-conjugated IgG secondary antibody(1:100) for 30 min.
% o/ b* L* \% {* |6 N9 Q8.        8.     Wash three times with FACS buffer 还是洗一遍  洗完加上FACS buffer 就可马上上机了
6 k- ?5 n, {8 k9.        9.     Add 0.5 ~ 1 ml of cold 1% Paraformaldehyde solution to the pellet.  这步是为了万一不能马上上机，长期保存用的，建议还是马上上的好
: I5 [; P9 o& _+ l10.        10. �Suspense cell immediately
" m  D) w7 [4 m4 v ! t8 N5 T, b3 o
11.        11. �Store the fixed cells at 4℃ in the dark
0 U0 P& {- J" a% _  m+ F& B6 n6 |! P12.        12. �These cells may be stored for at least one week prior to FACS analysis  9 O' ]+ F, l* W. |3 H
IMPORTANT: Protect from direct light
; Z" z& {/ u% _% M- I: J8 bFACS Buffer Preparation
5 A2 D4 B! ]6 q' C0 h, B 5mL 10% BSA (0.1% BSA)
4 u. I0 }! C+ l5 Z  V1mL 10% Azide
' J0 j/ z/ H6 m4 x' C! X! G3 ISome people add 2-4-5 mL EDTA Antichelating agent (prevents clumping)) c6 ~& b" T1 D& g
Make up to 500mL with 1x PBS
7 d- m0 |3 p  N4 ]. k* i1 ?

leisong12

准备一份不加任何抗体的细胞作为阴性就可以了，阳性对照没必要

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3 P, l, F0 D0 }/ C2 R* C非常感谢！